Принцип встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) заключается в одновременном движении в геле навстречу друг другу антигенов и антител под действием электрического тока.
В результате их специфического взаимодействия образуется линия преципитата. Метод сочетает простоту реакции диффузной преципитации в геле с высокой разрешающей способностью электрофореза. Хотя по чувствительности этот метод уступает методу флюоресцирующих антител и реакции непрямой гемагглютинации, однако для него не требуется люминесцирующих антител, люминесцентного микроскопа и эритроцитарного диагностикума.
ВИЭФ — качественный метод. Он отличается высокой специфичностью, прост в выполнении. Его можно применять для обнаружения бактериальных или вирусных антигенов в патологическом материале, органах лабораторных (биопробных) животных или объектах окружающей среды.
Материалы и оборудование. 1. Агароза А и В. 2. 0,05 М мединал— HCl буфер (pH 8,6). 3. Хлорид натрия. 4. Фосфат натрия двузамещенный. 5. Фосфат калия однозамещенный. 6. Хлорид калия. 7. Оксалат аммония. 8. Специфический бактериальный или вирусный антиген. 9. Камера для электрофореза. 10. Выпрямитель постоянного тока на 50 мА. 11. Термостат электрический суховоздушный. 12. Центрифуга лабораторная настольная.
Техника постановки. На стеклянную пластинку, установленную горизонтально, наливают 30 мл расплавленной 1%-й агарозы, приготовленной на мединал — HCl буфере (pH 8,6). После того как гель застынет, в нем пробойником вырезают два двойных ряда лунок диаметром 5 мм (по 8 лунок в каждом ряду); расстояние между двойными рядами составляет 30 мм. Из лунок удаляют гель, собирают в пробирку, растапливают над пламенем горелки и с помощью пастеровской пипетки вносят на дно лунок.
Со стороны катода помещают исследуемый материал, а со стороны анода — моноспецифическую сыворотку, но лучше моноклональные антитела (МКА) в объеме 0,035 мл. Например, для обнаружения пневмококка — антапневмококковую сыворотку, для выявления антигена вируса гриппа — противогриппозную и т. д.
Пластинку помещают в камеру для электрофореза таким образом, чтобы поролон, применяемый в качестве соединительного мостика между буферной системой и гелем-носителем, касался последнего. Электрофорез проводят при комнатной температуре при напряжении 140…150 В и силе тока 35 мА в течение 18…35 мин.
Контроль. Исследование материала в ВИЭФ на присутствие специфического антигена должно сопровождаться контролем с заведомо положительным материалом.
Обнаружение возбудителя при сочетании ВИЭФ с подращиванием. Для посева загрязненного материала следует использовать селективные среды.
После 36-часовой инкубации при 37 °С в чашку вносят 0,3 мл 0,85%-го раствора NaCl с 4 % формалина, делают смыв, который отсасывают в пробирку и после экспозиции в течение 1 ч исследуют в ВИЭФ.
Учет результатов. При положительном результате появляется линия прещшитата между лункой с исследуемым материалом и лункой со специфической сывороткой. Линия преципитата в зависимости от количества антигена в исследуемом материале может располагаться либо посередине расстояния между лунками, либо ближе к резервуару с сывороткой.
Обычно линии преципитата формируются через 18…35 мин после начала электрофореза.