После опытов Сталя и Мезельсона существование процесса удвоения ДНК при размножении живых организмов можно было считать доказанным.
Но все же о механизмах синтеза специфического белка можно было лишь только догадываться, так как дальнейшее проникновение в самую сокровенную тайну природы требовало более тщательных доказательств участия в этом процессе другой нуклеиновой кислоты рибозного типа — РНК. Существовала лишь схема, по которой предполагалось, что РНК принимает «эстафету» от ДНК. Но в таком случае нуклеотидный состав РНК должен был бы соответствовать нуклеотидному составу ДНК. Однако при тщательных исследованиях ученые столкнулись с большим разнообразием молекул РНК, причем молекулы РНК различались не только по молекулярному весу.
Ранее мы указывали, что РНК находится в основном в цитоплазме. Детальное исследование структуры клетки под электронным микроскопом позволило установить, что в цитоплазме встречаются очень мелкие образования — рибосомы. Осаждаются рибосомы только в самых высокоскоростных центрифугах, создающих ускорение, в несколько десятков тысяч раз большее, чем земное ускорение силы тяжести.
Химический анализ показал, что в состав рибосом входит белок и рибонуклеиновая кислота, которая получила название рибосомальной РНК.
Но в экстрактах из живых клеток был обнаружен еще один тип РНК, так называемая растворимая РНК. Очевидно, эти РНК выполняют различные функции.
Однако чтобы решить вопрос о молекулярных основах передачи биологической информации от ДНК к специфическому белку, необходимо исследовать свойства РНК и определить, какие функции выполняют обнаруженные типы РНК.
Оказалось, что в РНК нет такой явно выраженной регулярной структуры, как в ДНК. Поэтому метод рентгено-структурного анализа позволил только (Предположить, что в основе строения молекулы РНК лежит односпиральная структура и, может быть, в ней имеются отдельные участки с двуспиральной структурой.
При исследовании на содержание нуклеотидов оказалось, что правилу Чаргаффа, по которому число пиримидиновых нуклеотидов всегда равно числу пуриновых нуклеотидов, РНК подчиняется в меньшей степени. Кроме того, отношение (Г+Ц):(А+У) у всей клеточной РНК (напомним, что в РНК нет тимина, который заменен урацилом) меняется у различных видов в гораздо меньших пределах, чем у ДНК тех же видов. Следовательно, нуклеотидный состав РНК не соответствует соотношению нуклеотидов в ДНК того же вида.
Другими словами, осложнения у ученых, имевших дело с РНК, начались при первом же знакомстве с нею.
С помощью различных физико-химических методов удалось установить, что в отличие от ДНК молекула РНК характеризуется прежде всего сжатой, свернутой формой. Может быть, внутри этой свернутой структуры имеются внутренние связи, подобные связям между азотистыми основаниями нуклеотидов в молекуле ДНК? Оказалось, что это действительно так. При нагревании связи рвутся, и молекула РНК выпрямляется. Это удалось доказать советскому ученому А. С. Спирину.
Выше уже указывалось, что в клетке несколько типов РНК. Интересно, все ли они участвуют в передаче информации от ДНК к белку? Ясно, что информацию о последовательности нуклеотидов будет передавать РНК, нуклеотидный состав которой находится в соответствии с нуклеотидным составом ДНК клетки.
Ученые начали исследовать растворимую и рибосомальную РНК, изучая их нуклеотидный состав и определяя функции, которые они выполняют в клетке.
Прежде чем выстроиться в полипептидную цепь, аминокислоты непременно должны запастись энергией. Активируют аминокислоты универсальные энергетические вещества живой клетки — АТФ, после чего активированные аминокислоты присоединяются к молекулам растворимой РНК. Предполагают, что в клетке имеется по крайней мере 20 типов растворимой РНК, по одному типу на каждую аминокислоту.
Растворимая РНК осуществляет доставку аминокислот к месту синтеза белка. Поэтому более точное название этого вида РНК — транспортная РНК.
Молекулы транспортной РНК имеют сравнительно небольшой молекулярный вес — порядка 25—30 тысяч. Сейчас известна последовательность нуклеотидов только в конце цепи молекулы, причем она одинакова у всех 20 типов транспортной РНК — цитозин, цитозин, аденин. Очевидно, такая последовательность очень важна для протекания процесса активирования аминокислот, так как после отщепления трех концевых нуклеотидов молекула транспортной РНК теряет свою специфическую функцию — присоединять активированные аминокислоты.
Другая функция транспортной РНК в клетке сводится к тому, чтобы помочь аминокислоте легче попасть в рибосому. Ученые сравнили скорость проникновения в рибосому свободной аминокислоты и активированной, присоединенной к транспортной РНК. Выяснилось, что свободная аминокислота почти не входит в рибосомы, тогда как более крупная полимерная молекула транспортной РНК вместе с присоединенной аминокислотой легко проникает в рибосомальную частицу. Функции другой рибонуклеиновой кислоты — рибосомальной РНК еще очень мало изучены.
Она составляет большую часть всей РНК клетки — около 90%. Рибосомальные частицы оказались ответственны за синтез специфичного белка, так как именно в них и происходит соединение аминокислот в полипептидную цепь.
Если предположить, что последовательность аминокислот в белке определяется нуклеиновой кислотой рибосомы, то рибосомальная РНК должна точно копировать по нуклеотидному составу ДНК клетки. Однако такое соответствие не было обнаружено. Исследователи получили данные, которые указывают на неспецифичность рибосомальной РНК по отношению к синтезу специфичного белка. Большой для всех неожиданностью явилось открытие, что во время синтеза вирусов внутри бактериальной клетки белок вируса образовывался в старых рибосомах бактерий. Казалось бы, в зараженной фагом микробной клетке должны срочно синтезироваться новые рибосомы, содержащие РНК, по составу близкую к ДНК фага. Ведь последовательность нуклеотидов ДНК вируса сильно отличается от последовательности нуклеотидов бактериальной ДНК. А как мы знаем, все ресурсы зараженной вирусом клетки, в том числе и рибосомы, должны быть направлены на построение вирусов.
Однако факт остается фактом. Вирусный белок синтезировался именно на старых рибосомах бактерии, которые до этого синтезировали специфический белок бактериальной клетки.
В других опытах удалось прямо доказать, что рибосомы из одной клетки синтезируют специфический белок другой клетки, но при одном, немаловажном условии. О нем мы расскажем позже. Больше того, оказалось, что можно частично разрушить РНК рибосомы действием радиоактивного фосфора, включенного в состав РНК, и тем не менее рибосома продолжает прекрасно работать. Казалось, исследование зашло в тупик. В клетке не удавалось обнаружить РНК — переносчика информации с нуклеотидным составом, соответствующим составу клеточной ДНК. Но вскоре все прояснилось.
Исследуя различные РНК, появляющиеся в процессе размножения бактериофага, в 1958 году удалось обнаружить, что сразу же после инфекции в зараженной клетке появляется новый тип РНК. Правда, ее очень немного, но она имеет нуклеотидный состав, сходный с нуклеотидным составом ДНК фага. Эту РНК называли «информационной» или И-РНК, так как она переносит информацию (сведения о порядке расположения нуклеотидов в ДНК) к месту синтеза белка — рибосоме; там-то с безошибочностью и протекает процесс образования специфической белковой молекулы.
На возможность существования особого типа РНК как промежуточного звена в переносе генетической информации указывали в том же 1958 году советские ученые А. Н. Белозерский и А. С. Спирин. Это предположение возникло из анализа коэффициента специфичности ДИК различных видов бактерий, который варьировал от 0,5 до 2,8, то есть в весьма строгих пределах. Соответствующий коэффициент суммарной РНК тех же видов менялся всего на 20%, но соответствовал изменению нуклеотидного состава ДНК.
Сообщение об открытии И-РНК вызвало настоящую революцию в молекулярной биологии, и сразу появилось много работ, посвященных изучению ее структуры и функции.
В процессе роста клеток постоянно происходит синтез белка, а значит, И-РНК должна существовать и в обычных, незараженных бактериальных клетках. Ее обнаружить там трудно, так как она чрезвычайно быстро возникает и столь же стремительно исчезает.
Выделение И-РНК даже в малых количествах, необходимых для химического анализа, весьма напоминает добычу золота, когда добытчикам приходится перемывать тонны золотоносной породы для получения граммов драгоценного металла. Если при добыче золота используется его свойство — большой удельный вес и способность оседать на дно, когда более легкая порода смывается, то при «добыче» И-РНК ученым помогает ее особенность быстро синтезироваться в клетках.
Сейчас почти во всех биохимических лабораториях применяется метод меченых атомов. Этот метод особенно пригодился при исследовании свойства И-РНК. Ученые обнаружили, что бактериальные клетки, которые были выращены на среде богатой питательными веществами, синтезируют И-РНК в том случае, если их заставили голодать, то есть перенесли в «бедную» среду. В этот момент добавляют меченое азотистое основание — радиоактивный урацил, который включается в И-РНК. Путем дальнейшей очистки удалось получить препарат И-РНК без сопутствующих примесей, так как о ее присутствии давал знать радиоактивный распад атомов урацила.
Молекулярный вес И-РНК оказался больше, чем у транспортной и рибосомальной РНК. Есть указания, что он приближается к нескольким миллионам. У И-РНК оказались сходными с ДНК не только нуклеотидный состав, но и некоторые физико-химические свойства. Если И-РНК нагреть вместе с ДНК, к которой она имеет сродство (как говорят, гомологична), то они образуют прочный комплекс.
В последнее время получены доказательства исключительной роли И-РНК в процессе переноса генетической информации от ДНК к синтезируемому белку.
Мы уже упоминали об опыте, который показал, что рибосомы, выделенные из одних клеток, могут синтезировать белок, специфический для других клеток, но при одном лишь условии. Этим условием было обязательное присутствие И-РНК. Когда из молодых клеток костного мозга кролика выделяли рибосомы и добавляли к ним экстракт из разрушенных клеток, источники энергии, аминокислоты для синтеза белка и другие необходимые вещества и, что самое главное, добавляли И-РНК из клеток костного мозга овцы, то в системе синтезировался гемоглобин овцы. Этот опыт доказал, что не рибосомальная РНК определяет последовательность аминокислот в белке, а И-РНК.
Аналогичные опыты были поставлены с РНК вируса табачной мозаики. Этот вирус паразитирует на листьях табака, но исследователи заставили вирусную РНК работать как И-РНК и синтезировать белок на рибосомах, выделенных из бактерий кишечной палочки. Ученые изучили свойства искусственно синтезированного белка и обнаружили, что это — специфический белок вируса табачной мозаики, обладающий теми же иммунологическими свойствами, что и белок природного вируса.
В цепи доказательств того, что И-РНК участвует в передаче генетической информации о последовательности нуклеотидов к рибосомам, отсутствовало очень важное звено: был неизвестен молекулярный механизм синтеза ДНК, подобной РНК. В 1961 году американец Вейсс открыл ферментную систему, которая, подобно полимеразе Корнберга, синтезировала РНК прямо на молекулах ДНК. Так же как и в опытах Корнберга, для синтеза РНК требовалось присутствие всех четырех нуклеозидтрифосфатов (только углевод был представлен рибозой, а тимин заменен урацилом). В качестве «затравки» использовалась ДНК. Для доказательства идентичности получаемого продукта по нуклеотидному составу с ДНК были внесены «затравки» из различных биологических источников с разным нуклеотидным составом; синтезируемая РНК всегда соответствовала ДНК-«затравке»..
С помощью этих опытов удалось показать передачу «эстафетной палочки» биологической специфичности от ДНК к ДНК — подобной РНК.