Излагая основные положения генетики, совершенно необходимо привести некоторые данные о генетике нейроспоры. Нейроспора занимает в генетике особое положение, поскольку изучение ее позволило получить много данных о связи генетической конституции с биохимическими особенностями.
Уже давно было ясно, что мутации проявляются в изменении биохимических признаков. Это, собственно, перефразировка общего положения о проявлении мутаций только в вызываемых ими изменениях фенотипа, а фенотип организма — это, по-видимому, сумма его биохимических особенностей. Исследования Лауренса, Скот-Монкрифф и их сотрудников, изучавших генетическую регуляцию структуры пигментов цветка, помогли установить, что химическое строение этих пигментов определяется отдельными генами, которые регулируют степень метоксилирования, гидроксилирования или связывания с углеродами особых гетероциклических соединений, называемых антоцианами. Уже на основании этих исследований было высказано предположение, что изменения одного гена приводят к изменению какого-либо специфического процесса биосинтеза.
Среди диких штаммов нейроспоры можно отобрать такие, которые могут расти на очень простой культуральной среде, содержащей в основном сахар, соли и единственный витамин — биотин. Подвергая такие культуры воздействию какого-либо мутагенного фактора (например, рентгеновских лучей), можно получить мутанты, уже неспособные расти на минимальной среде, а нуждающиеся в добавлении питательных веществ, таких, как дрожжевой экстракт, гидролизаты белков и нуклеиновые кислоты. Систематически расчленяя добавляемую смесь на отдельные компоненты, можно установить, в каком именно питательном веществе возникла потребность вследствие мутации. Выделить мутантные формы с четко выраженной потребностью в определенном питательном веществе не всегда легко. Было выделено немало микроорганизмов, дающих спонтанную реверсию к дикому типу или же сохраняющих способность расти на минимальной среде, хотя и гораздо медленнее. Однако в настоящее время выделено много стабильных ярко выраженных мутантов, нуждающихся для своего роста в добавлении к основной питательной среде какого-либо одного питательного вещества (той или иной аминокислоты, пурина, пиримидина или витамина). Поскольку нейроспора обладает обычным хромосомным механизмом наследования, положение этих мутантных локусов можно установить классическим методом изучения перекреста.
При бесполом размножении гаплоидные конидии, прорастая, дают гаплоидный мицелий. Увеличение массы происходит за счет простого роста уже имеющегося мицелия путем митозов и использования питательных веществ из окружающей среды. При половом размножении происходит взаимное оплодотворение между двумя типами мицелиев, обозначаемых буквами А и а или знаками + и —. Конидии этих двух типов, по-видимому, отличаются друг от друга лишь единственным генетическим локусом в одной из хромосом. При скрещивании гаплоидные ядра мицелиев двух половых типов попадают в одну и ту же цитоплазму. Далее ядра обоих половых типов претерпевают многочисленные эквационные деления, а затем сливаются попарно с образованием диплоидной зиготы. В этой зиготе затем происходит два мейотических деления и образуется четыре гаплоидных ядра. Эти ядра затем делятся митотически и дают восемь аскоспор. Если на такие споры воздействовать теплом или другими раздражителями, то они начинают прорастать.
Одно из преимуществ нейроспоры как объекта для экспериментальных генетических исследований состоит в том, что события, происходящие при мейозе, отражаются в образующихся в конечном счете аскоспорах. Два верхних и два нижних ядра, имеющихся на четырехъядерной стадии, происходят от верхнего и нижнего ядер двуядерной стадии; такая же закономерность сохраняется и при последующем митотическом делении. Отдельные аскоспоры можно извлечь из сумки по порядку.
Для некоторых мутаций, вызывающих появление заметных различий во внешнем виде зрелых аскоспор, можно без генетического анализа отдельных спор определять частоту перекреста в течение мейоза и положение определенного локуса на карте, причем за нулевую точку принимают центромеру. Это хорошо иллюстрируется примером, взятым из работы Д. Стадлера, посвященной необычному мутанту, нуждающемуся в лизине. У этого мутанта (один из штаммов, нуждающихся в лизине, исследованных Н. Гудом в 1951 г.) наблюдается задержка в образовании аскоспор и внутри сумки легко различить бесцветные мутантные споры. Несмотря на задержку в созревании спор, этот ненормальный штамм удается размножать благодаря возможности культивировать вегетативный мицелий неограниченно долгое время без полового размножения, а также благодаря тому, что иногда отдельные мутантные споры, в конце концов, созревают.
Основные стадии мейоза после скрещивания. Две гаплоидные конидии сначала сливаются с образованием зиготы a1. Известно, что в начале первого мейотического деления эта зигота содержит двойной набор хромосом a2. В период первого мейотического деления между двумя родительскими наборами хромосом может произойти перекрест (но его может и не быть). У нейроспоры центромеры каждой родительской хромосомы во время первого мейотического деления не расщепляются, и пары хромосом, в которых произошел перекрест, остаются соединенными. Предполагается, что частота перекреста для любого аллеля в период первого мейотического деления зависит от расстояния между данным локусом и центромерой.
Во время второго мейотического деления каждое ядро дает два дочерних и образуется четыре ядра, расположенных в один ряд: два нижних и два верхних ядра получаются в результате деления нижнего и верхнего ядер двуядерной клетки. Если перекреста не произошло, то ядра располагаются в порядке; в случае же перекреста ядра могут расположиться четырьмя различными способами.
Споры, содержащие мутантный локус, бесцветны, и их легко отличить по внешнему виду. В 9 из 14 зрелых сумок перекреста не произошло, т. е. расщепление по данному локусу произошло во время первого мейотического деления. В 5 сумках наблюдается картина, свидетельствующая о расщеплении во время второго мейотического деления: в одной споры чередуются, а в четырех располагаются симметрично. Таким образом, в 5/14 зрелых сумок в период развития из зиготы произошел перекрест. Если принять, что гены расположены линейно, что имеется прямая зависимость между частотой перекреста и линейным расстоянием и что при первом мейотическом делении центромера не делится, то можно рассчитать, что мутантный локус находится на расстоянии 1/14 · 100 от центромеры, что составляет 36% расстояния между центромерой и концом хромосомы. (При составлении карты для нейроспоры это расстояние делят на два, так как за единицу принимают половину полученной величины).
Стадлер показал, что величины, выражающие частоту перекреста, значительно варьируют в разных скрещиваниях; это часто наблюдается в генетической практике. Для точного нанесения на карту определенного локуса необходимо провести ряд скрещиваний с участием трех различных маркеров или двух маркеров и центромеры; проверкой должно служить суммирование процентов перекреста между близко расположенными генами. Мы привели здесь этот пример, потому что он показывает, как приблизительно определить положение на карте мутантного локуса у нейроспоры, не прибегая к многочисленным скрещиваниям потомков, если мутация вызывает ясно выраженное изменение в тех признаках аскоспор, которые обычно используют для учета.
Огромное значение использования мутантов нейроспоры для связи между генетикой и биохимией ясно из следующего примера. Было выделено три генетически различных мутанта, которые растут при добавлении к минимальной среде одной из трех аминокислот — аргинина, орнитина и цитруллина, двух из них или всех трех. Мутант 1 может расти лишь при добавлении аргинина и неспособен использовать цитруллин или орнитин. Мутант 2 может использовать и цитруллин и аргинин, а мутант 3 — любое из этих трех питательных веществ. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что аргинин, возможно, образуется в результате ряда последовательных реакций. Приняв эту биохимическую гипотезу, можно предположить, что каждый из мутировавших локусов этих трех мутантов влияет на специфический ферментативный процесс в цепи реакций, ведущей к синтезу аргинина. Правильность такого предположения подтверждается тем, что мутанты с измененными пищевыми потребностями обычно способны использовать для своего роста лишь те метаболиты, которые вступают в игру после блокированной ступени, но не предшествующие ей метаболиты. В самом деле, в большинстве случаев наблюдается накопление промежуточных метаболитов, предшествующих блокированной ступени.
Определенная последовательность реакций, ведущая к образованию аргинина, хорошо установлена для многих организмов. Таким образом, исследование трех мутантов нейроспоры в основном лишь подтвердило эту последовательность. Однако оно представляет большой исторический интерес, поскольку это был один из первых ярких примеров, показавших непосредственную связь между ферментативными возможностями организма и его наследственностью. В других исследованиях подобного рода результаты изучения мутантов часто служили первыми вехами в выяснении новых метаболических путей.
Наиболее значительным следствием изучения наследования потребностей нейроспоры в различных питательных веществах была, вероятно, высказанная Бидлом, Татумом и их сотрудниками гипотеза «один ген — один фермент». Эта гипотеза, согласно которой каждый ген контролирует синтез лишь одного фермента или другого специфического клеточного белка, весьма гибка и растяжима. Ее интерпретация непосредственно зависит от значения, которое вкладывается в термин ген. А именно: на примере псевдоаллелей гена lozenge у дрозофилы было показано, что при помощи все более тонких методов генетического анализа становится возможным проводить различие между локусами, входящими в одну функциональную единицу. На основании относительно грубого анализа, проведенного при изучении трех мутантов, влияющих на синтез аргинина, мы не можем утверждать, что, например, у мутанта 2 блокирована именно та ступень, которая непосредственно связана с образованием цитруллина, или же блокирован один из многочисленных этапов между орнитином и цитруллином. Вместе с тем тщательный генетический анализ, возможно, позволил бы обнаружить два локуса, расстояние между которыми по длине генетической нити настолько мало, что они образуют одну функциональную единицу. Мутация в любом из этих локусов может изменить или уничтожить биологическую активность одной и той же молекулы белка. Такое положение действительно было обнаружено для ряда микроорганизмов и бактериофагов. В дальнейших главах этим явлениям уделено много внимания.
Прекрасным примером прямой взаимосвязи каждого белка с одним геном может служить синтез двух типов тирозиназы у нейроспоры. Горовиц и его сотрудники показали, что мутация в одном генетическом локусе вызывает образование чувствительной к высокой температуре тирозиназы, которая по всем остальным физическим и кинетическим особенностям неотличима от обычной тирозиназы, устойчивой к высокой температуре. Обе формы фермента можно получить в чистом виде, и не может быть сомнения в том, что генетическое изменение затронуло единственную молекулу белка. Различия между двумя ферментами наследуются строго по Менделю, т. е. определенный чистый штамм нейроспоры образует лишь одну форму фермента, а в потомстве от скрещивания между двумя штаммами получаются в одинаковом числе формы, идентичные родительским.
Возможные следствия этих, а также других сходных взаимоотношений между геном и белком относятся к наиболее увлекательным проблемам биологии. В самом деле, если какое-либо незначительное изменение в молекуле белка строго соответствует столь же незначительному изменению в молекулярной структуре генетического материала, то перед нами открывается большая новая область для исследований и гипотез, касающихся наиболее важных аспектов эволюционного процесса.