Большинство грибных возбудителей болезней можно выделить из пораженных растений в чистую культуру на питательном субстрате.
Исключение составляют лишь некоторые облигатные паразиты, например настоящие мучнисторосяные и ржавчинные грибы или возбудитель рака картофеля. Их требования к питательному субстрату недостаточно изучены, поэтому культуре in vitro поддаются только отдельные ржавчинные грибы в начальной стадии развития. Выделение этих возбудителей всегда связано с заражением новых растений.
Стандартный метод. Пораженные растения моют под проточной водой, затем отделяют больные части для дальнейшей обработки. Если речь идет о пожелтении или увядании, то в исследования следует включить нижнюю часть стебля и корень. Все последующие работы проводят в отдельном очень чистом помещении, относительная стерильность которого обеспечивается предварительным 1—2-часовым облучением бактерицидной лампой. Руки и рабочую поверхность стола тщательно протирают 40%-ным спиртом, все необходимые инструменты (пинцеты, скальпели, ножницы,
иглы) погружают в 70%-ный спирт. Затем части растений, предназначенные для выделения патогена, разрезают на кусочки длиной 1—2 см, так чтобы переходная часть от здоровой ткани к пораженной находилась посредине кусочка.
Материал поверхностно дезинфицируют различными средствами. Стандартный метод — это погружение материала в 0,5 %-ный раствор сулемы на 2 мин. Для очень нежных частей, например тонких листочков, применяют раствор меньшей концентрации (0,1%) или сокращают время обработки. Затем обожженным в спирте пинцетом материал переносят в стерильную воду и трижды ополаскивают для удаления дезинфицирующего вещества.
Стерильную воду получают заранее путем автоклавирования дистиллированной воды в течение 20 мин при 120 °С. Из последней порции промывной воды материал с помощью стерильного пинцета переносят на дезинфицированную рабочую поверхность, острым обожженным в спирте скальпелем отрезают кусочки величиной 1 — 2 мм и переносят по 3—5 штук в чашки Петри с агаром. Можно также держать материал пинцетом над открытой чашкой с агаром и стерилизованными ножницами отрезать маленькие кусочки, а затем обожженной в спирте иглой распределить их по другим чашкам.
Для выделения пригодны стандартные среды: биосолодовый агар, картофельно-декстрозный агар, агар на пивном сусле. Во многих случаях целесообразно применять селективные среды, благоприятные для роста соответствующего возбудителя. Вначале изоляты инкубируют в термостате при 20 °С, обязательно учитывая особые требования некоторых патогенов к температуре. В последующие дни чашки следует просматривать ежедневно.
Как только исследуемый возбудитель начнет прорастать из срезов материала и выходить на питательный субстрат, мицелий следует перенести на чистую среду.
Многие грибы можно узнать по типичному росту молодого мицелия. Если это не удается, мицелий различного вида следует перенести в разные чашки и затем определять по типу спороношения.
Мицелий, растущий не из мест среза, представляет грибы-загрязнители, в основном многочисленные виды рода Penicillium. Кроме того, частыми загрязнителями являются представители родов Fusarium, Alternaria, Aspergillus, Rhizopus и дрожжевые грибы. Они образуют розоватую или желтоватую слизь, и при визуальном обследовании их легко принять за бактерии, которые также могут быть нежелательными загрязнителями. Если загрязнения появляются только в отдельных местах чашки, их можно в самом начале роста видимого мицелия устранить, нанеся несколько капель абсолютного спирта или молочной кислоты или вырезав дезинфицированным шпателем. В более поздней стадии удаление загрязнителей себя не оправдывает, поскольку такие грибы, как правило, рано и обильно спорулируют. Споры легко распространяются по всей поверхности не только при удалении кусочка загрязненного агара, но даже при простом открывании чашки. В результате позднее не удается получить чистую культуру возбудителя болезни.
Примечание. Особенно много сложностей при выделении грибных возбудителей создает загрязнение бактериями. Подавить рост бактерий можно путем добавления в среду 0,5 М/л роданида калия или 100 мг/л стрептомицина. Хорошие результаты дает также применение 50%-ной молочной кислоты, по 1—2 капли которой вносят в чашки Петри перед разливом среды. Чтобы освободить грибные культуры от бактерий, мицелий пересевают на чистую среду следующим образом. В агаре с помощью обожженного в спирте шпателя вырезают сектор, слегка приподнимают его и на дно чашки помещают мицелий. Проросший через агар и свободный от бактерий мицелий позднее пересевают на новую среду. Кроме того, культуру гриба можно очистить методом бороздки: в чашке Петри рядом с загрязненной культурой патогена прорезают шпателем бороздку шириной около 8 мм. Позднее прорастающий через нее мицелий также пересевают на новую среду.
В литературе опубликованы специальные методы выделения многих возбудителей, ставящие целью стимулировать рост соответствующих патогенов и свести к минимуму или исключить загрязнение нежелательными микроорганизмами. Ниже приведены только некоторые примеры.
Выделение возбудителя фитофтороза картофеля (Phytophthora infеstarts). Этот патоген можно выделить из листьев, стеблей и клубней слабопораженных растений картофеля.
В качестве питательной среды подходит ржаной шрот-агар. Мицелий, развивающийся из изолированных кусочков растительного материала, переносят на клубни картофеля. Для этого здоровые клубни среднего размера тщательно моют в проточной воде и поверхностно дезинфицируют. С противоположных концов клубня дезинфицированным скальпелем делают клиновидный вырез, на дно выреза иглой переносят мицелий, вставляют клин и заклеивают клейкой лентой. По 4—5 клубней помещают во влажные камеры соответствующего размера и инкубируют при 18—20 °С. Через 4 дня клубни дезинфицированным скальпелем разрезают пополам, переносят в другую влажную камеру и выдерживают еще 8 дней при 14—15 °С в холодильнике.
За это время на поверхности срезов развивается белый налет мицелия и зооспорангиев, который можно легко перенести на агаризованную питательную среду, в питательный раствор или снова на клубни картофеля.
Выделение возбудителя ожога коры яблони (Pezicula malicoriicis, син. Gloeosporium perennans). По данным Фике с соавт., для выделения возбудителя ожога коры пораженные ткани пересаживают в незрелые яблоки и проводят инкубацию при комнатной температуре во влажной камере или в пленочных пакетах. Через 5—6 недель на поверхности плодов образуются спороложа с большим количеством конидий, которые можно использовать для идентификации возбудителя и выделения его в чистую культуру на различных видах агара (биосолодовый, картофельно-декстрозный, фасолевый, глицерино-пептонный).
Выделение возбудителя глазковой пятнистости и ломкости стеблей зерновых (Pseudocercosporella herpotrichoides). Этого возбудителя легче всего изолировать из зеленых стеблей (см. стандартный метод). Однако иногда возникает необходимость в изоляции его из сильно загрязненной стерни или соломы.
По методике Ланге де ла Кампа предметные стекла, стеклянные кольца диаметром 12—15 мм и высотой 8—10 мм, покровные стекла и стеклянные палочки вначале стерилизуют 3 ч в сушильном шкафу.
Кольца, края которых с двух сторон смазаны вазелином, по 1—2 штуки прижимают к предметным стеклам. Исследуемую соломину тщательно очищают от листьев и остатков корней, промывают в проточной воде и поверхностно дезинфицируют с помощью кисточки, смоченной эфиром. Дезинфицированными ножницами соломину разрезают поперек пораженных участков на кусочки величиной 1—2 мм. На покровное стекло наносят каплю расплавленного солодового, картофельно-декстрозного или агара на пивном сусле, погружают в нее кусочек соломины, и покровное стекло каплей вниз накладывают на кольцо, прикрепленное к предметному стеклу. Предметные стекла помещают во влажную камеру и инкубируют в термостате при 18—20 °С.
В последующие дни растущий мицелий можно обследовать под микроскопом в стерильных условиях, не снимая покровного стекла. Р. herpotrichoides формирует типичные метельчатые пучки мицелия. Выросший без загрязнения мицелий переносят в чашки с агаром и лишь при появлении спор точно определяют возбудителя. Спорообразование на мицелии можно стимулировать путем облучения культур УФ-светом в течение 12—14 дней.
Выделение из семян (стандартный метод). При выделении фитопатогенных грибов из семян следует различать возбудителей, находящихся на поверхности семян в виде спор и проникших в оболочку в виде мицелия. В первом случае выделение осложняется присутствием на поверхности семян спор загрязнителей. Один из возможных вариантов состоит в следующем.
Семена засыпают в стерильную воду и сильно встряхивают. Затем готовят ряд последовательных разведений и последние ступени разведения наносят на агар, в который для подавления роста бактерий добавлены антибиотики. Развившиеся после короткой инкубации при 20 °С колонии отсевают в чашки Петри со стандартной питательной средой, культивируют до спорообразования и проводят определение. Еще одну возможность выделения фитопатогенов дает метод Ульстера.
Проверка семенного материала по Ульстеру. Исследуемые семена без специальной обработки раскладывают на солодовый агар в чашки Петри диаметром 90 мм и инкубируют при 22—24 °С. Число семян на чашку в зависимости от их крупности колеблется от 3X3 до 5X5. Расстояние между семенами должно быть достаточным, чтобы предотвратить быстрое зарастание семян загрязняющими их грибами. При определенном навыке лаборант с помощью этого метода может дать оценку зараженности семенного материала, но выделение какого-то возбудителя осложняется из-за высокой степени загрязнения материала непатогенными микроорганизмами.
Если мицелий возбудителя уже проник в оболочку семян, та семена сначала поверхностно дезинфицируют и затем при необходимости разрезают пополам острым обожженным в спирте скальпелем. Половинки семян раскладывают на стандартную среду и инкубируют, изоляты мицелия, растущего на поверхности срезов, переносят в новые чашки с агаром и культивируют до спорообразования. Мицелий различной окраски и формы роста следует разделить, при некотором навыке лаборант может идентифицировать возбудителя.
Новозеландский метод. При проверке материала новозеландским методом семена сначала промывают 5 мин сильной струей воды, затем ополаскивают стерильной водой, раскладывают в чашки Петри и осторожно заливают агаром. Для этой цели пригоден агар на сливовом отваре, охлажденный перед разливом примерно до 45 °С. После инкубации при 20—22 °С можно определять грибные культуры.
Выделение Pleospora bjoerlingii (Phoma betae) из клубочков свеклы. Клубочки свеклы без предварительной обработки раскладывают в чашки Петри на тонкий слой специальной среды по Багби и инкубируют при 20 °С. Через 2—3 дня мицелий P. betae прорастает через субстрат и образует на дне чашки видимые невооруженным глазом мелкие черные структуры типа микросклероциев (так называемые структуры Гольдфаста). Перевернув чашку, их можно высвободить из субстрата и перенести на картофельно-декстрозный агар, следя за тем, чтобы на агар не попали грибы-загрязнители, особенно виды Alternaria. После 8—10-дневной инкубации при 20 °С на картофельно-декстрозном агаре появляются пикниды P. betae, содержащие пикноспоры, по которым можно идентифицировать возбудителя.
Еще одна возможность обнаружения P. betae в клубочках свеклы — исследование проростков на пораженность. Отобранные клубочки высевают в стерильную почву, после появления всходов растения вынимают из почвы, промывают и исследуют. Экземпляры с побуревшими корнями и гипокотилем погружают в раствор гипохлорита натрия и раскладывают на картофельно-декстрозном агаре; после 8—10-дневной инкубации P. belae можно четко определить по пикнидам и пикноснорам.
Обнаружение зараженности семян сельдерея видами Septoria. По 100 семян сельдерея помещают на 24 ч в 5 мл стерильной воды, затем этой водой опрыскивают 5-недельные сеянцы сельдерея. Через 3 недели возбудителя идентифицируют по пикнидам, образующимся на листьях. При этом можно количественно определить степень зараженности исследуемых партий но числу пикнид.
Выделение из плодов. Выделение фитопатогенных грибов из плодов проводится в принципе методами, уже описанными. Поверхностно дезинфицированные плоды разрезают на ломтики, включающие переходную зону от здоровой ткани к пораженной, и раскладывают на стандартной среде. Если возбудитель образует на поверхности плодов споры, мицелий или плодовые тела, то их можно перенести иглой или петлей в стерильную воду и приготовить ряд разведений. Выдерживание поверхностно дезинфицированных плодов во влажных камерах стимулирует выход из пикнид цепочек спор. Их переносят обожженной в спирте петлей в стерильную воду и используют как концентрированный исходный материал для получения разведений.