При образовании возбудителем спор на зараженном растении, как правило, удается определить род и вид патогена.
В особых случаях, когда нужно идентифицировать расы, встречающиеся в популяции, необходимо выделение моноспоровых линий. Для этого используют микроманипулятор — приспособление к микроскопу, позволяющее с помощью двух стеклянных игл или аналогичного инструмента под контролем переносить на питательную среду отдельные споры из суспензии или из массы, распыленной на предметном стекле.
Работу следует проводить по возможности в стерильных условиях. Она требует спокойных, точных движений и определенных навыков. Ниже описаны две методики получения моноспоровых линий, не требующие применения микроманипулятора.
Выделение моноспоровых линий на всходах растений. Споры облигатных паразитов, например настоящих мучнисторосяных и ржавчинных грибов, переносят на проростки растений поодиночке. Вначале защищенные от посторонней инфекции растения выращивают до фазы двух листьев в маленьких горшках диаметром 4—5 см. Второй лист срезают, оставшийся первый лист опрыскивают водой. Исходным материалом для получения конидий служат пораженные мучнистой росой растения, с которых в конце предыдущего дня стряхивают образовавшиеся споры. Моноспоровые линии получают из конидий, сформировавшихся ночью, стряхивая их на сухую стеклянную пластинку. Конидии не должны лежать слишком плотно, поэтому предварительно растения целесообразно резко отряхнуть за пределами стеклянной пластинки. Затем по стеклянной пластинке и по увлажненному листу прокатывают ватную пробку (один оборот). Горшки с растениями помещают изолированно в маленькие камеры и со второго дня ежедневно просматривают. В идеальном случае на листе образуется только одна пустула мучнистой росы, которую переносят для размножения на другое растение. Если через несколько дней на листе появляются 2—3 легких хлороза, на которых позднее формируются пустулы, то этот лист еще до образования мицелия можно разрезать на кусочки с видимыми поражениями. При большем числе мест поражения лист выбрасывают, так как возникает опасность смешивания различных рас.
Описанный метод можно модифицировать соответственно конкретным условиям. Например, после появления признаков заражения, но до отделения спор листья разрезают на части с одним пораженным участком на каждой и помещают в раствор бензимидазола или агаризованный бензимидазол (40 мг/л) до образования достаточно крупной пустулы, которую можно перенести на следующие растения. Еще одна возможность состоит в следующем: в горшках выращивают по три растения, инфицируют их с помощью ватной пробки, извлекают то растение, на котором образовалось меньше всего пораженных участков, и разрезают его на кусочки, каждый с одним поражением. Оставшиеся растения в дальнейшем не используются.
Точная идентификация рас происходит после промежуточного размножения моноспоровой линии путем переноса на соответствующий тест-сортимент.
Моноспоровые линии ржавчинных грибов получают в принципе аналогичным путем. Исходным инфекционным материалом служит очень слабая суспензия спор, которую акварельной кисточкой переносят на первый лист проростка; восковой слой следует предварительно стереть пальцами.
Выделение моноспоровых линий на питательный субстрат. Этот процесс выделения моноспоровых линий применяется при работе с факультативными возбудителями болезней. Образовавшиеся на растениях спорокучки или плодовые тела, например пикниды, зрелые перитеции, переносят в автоклавированную водопроводную воду, получая суспензию спор. Для моноспоровых линий в дальнейшем необходимы предметные и покровные стекла, стеклянные кольца высотой 8—10 мм и диаметром 12—15 мм, стерилизованные 3 ч при 180 °С, а также треугольные флажки из фильтровальной бумаги длиной 10 и шириной 5 мм. Так как фильтровальная бумага при стерилизации в термостате теряет поглотительную способность, флажки целесообразно стерилизовать в закрытых чашках Петри, поместив их на 20 мин в автоклав при 120 °С. Наконец, нужны чашки Петри со стандартной питательной средой, пинцет, пишущая ручка с большим числом заостренных перьев, копировальный карандаш или стеклограф, а также вазелин и микроскоп.
Сначала готовят так называемую камеру Бёттхера — стеклянное кольцо, покрытое по краям вазелином и закрепленное на предметном стекле. Затем прокаленным пером наносят 9 (3×3) или 16 (4X4) капель суспензии на покровные стекла, помещают их каплями вниз на приготовленные стеклянные кольца и просматривают под микроскопом. Все капли, содержащие только одну спору исследуемого гриба, маркируют карандашом на покровном стекле. Затем по мере надобности отмеченные капли всасывают острым углом флажка, удерживаемого прокаленным пинцетом, и переносят в чашки Петри с питательной средой. При этом нужно следить за тем, чтобы угол флажка входил в питательную среду плоско, так как при слишком глубоком погружении гриб может развиваться очень плохо, а при поверхностном нанесении высыхает. Чашки инкубируют при 20 °С. Работа этим методом требует определенного навыка.
Еще одна возможность получения моноспоровых линий — это метод разведения по Коху.