Методы, предназначенные для полного извлечения липидов из зерновых продуктов, основаны, как правило, на обработке водным этиловым спиртом, когда необходимо избежать гидролиза липидов, или смесью спирта с кислотой, если гидролиз не является нежелательным. Проблемы усовершенствования соответствующих методов обсуждаются рядом авторов: Гертвигом, Антенером и Хеглем и Миэра.
Официальный метод, предложенный Ассоциацией агрохимиков для муки и продуктов переработки зерна, таких как макароны и лапша, где тесто подвергается формовке и продукт представляет плотный стекловидный материал, предусматривает нагревание исследуемого образца в 70%-ном водном этиловом спирте с последующей экстракцией эфиром.
Как впервые показал Дилл, необходимость и эффективность такой обработки наиболее очевидны в случае с клейковиной. Из типичной (средней) клейковины, высушенной в вакуумном сушильном шкафу и растертой так, чтобы обеспечить просеивание через сито 80 меш, эфир экстрагировал только 0,75% липидов; но после обработки 70%-ным водным спиртом по методу Гертвига извлекалось 7,05%. Раск и Фелпс описали метод извлечения липидов из продуктов переработки зерна, особенно из макарон и лапши, основанный на использовании аммиака в водном растворе этилового спирта. Салливэни Ниэр модифицировали этот метод и применили его для исследования трех образцов клейковины; при этом было получено 8,5; 10,6 и 11,1% липидов вместо 0,3% (и ниже), получаемых в случае извлечения эфиром. Незначительное извлечение липидов из клейковины, высушенной в вакуумном сушильном шкафу, можно частично объяснить непроницаемостью для эфира ее частиц. В то же время из лиофильно высушенной клейковины, имеющей более открытую структуру, удавалось извлечь эфиром от 2 до 3% липидов. Однако извлечение дополнительного количества липидов требовало использования более полярных растворителей для отделения липидов от белковых компонентов.
Небольшое количество липидов очень крепко удерживает также пшеничный крахмал. Используя метод кислотного гидролиза, предложенный Ассоциацией агрохимиков, Шоч в двух партиях пшеничного крахмала нашел 0,50 и 0,64% липидов, которые можно было извлечь горячим 85%-ным метиловым спиртом или 80%-ным диоксаном. В экстрагированных сухих остатках обнаружено 2,25% фосфора. Хотя содержание липидов в крахмале сравнительно невелико, сам крахмал составляет столь значительную часть муки, что общее количество содержащихся в нем липидов может составлять довольно значительную долю в общей сумме липидов муки.
Хотя обработка смесью полярных растворителей и воды и является необходимой для того, чтобы сделать липидные вещества в упомянутых продуктах переработки зерна более доступными извлечению эфиром, тем не менее гораздо чаще используется более продолжительная обработка 95%-ным или абсолютным этиловым спиртом. Установлено, что этот метод достаточно эффективен в отношении муки и некоторых других продуктов переработки зерна. Так, количество липидов, извлеченных из муки при 48-часовой экстракции смесью этиловый спирт — эфир (1 : 1) при комнатной температуре, оказалось равным количеству, экстрагированному при двух более жестких методах обработки, включавших переваривание папаином или обработку спиртовым раствором соляной кислоты.
Методы, сочетающие обработку кислотой или щелочью с экстракцией этиловым спиртом, сравнивали с простой экстракцией спиртом. Для пшеничных зародышей полученные результаты хорошо совпадали. В случае с мукой простая экстракция этиловым спиртом удаляла несколько больше липидов, содержавших, однако, большее количество азота, в связи с чем можно предположить присутствие в экстракте белковых веществ. Данные, полученные при исследовании отрубей, вызывают сомнение в полноте извлечения липидов при использовании одного спирта, поскольку обработка кислотой давала большее извлечение (6,73 вместо 4,99%), причем вытяжка содержала меньше азота и фосфора.
Помимо этилового спирта, для извлечения липидов используются также водонасыщенный бутиловый спирт, водный метиловый спирт в смеси с хлороформом и водный ацетон. Водонасыщенный бутиловый спирт разрывает липоидно-белковые комплексы в молоке, различных животных тканях и кутикуле насекомых. Этот растворитель извлекает из муки также максимальное количество пигментов. Поэтому проведено сравнение количества липидов (веществ, растворимых в хлороформе), извлекаемых из образцов клейковины, муки, цельной пшеницы и отрубей при экстракции этиловым спиртом в аппарате Сокслета, с количествами, полученными при экстракции при комнатной температуре водонасыщенным н-бутиловым спиртом. Из клейковины оба растворителя извлекали почти одинаковые количества липидов. В случае с мукой различия между растворителями были также незначительными. Однако в случае с цельной пшеницей и особенно с отрубями бутанольный растворитель извлекал больше липидов — для трех образцов отрубей около 6,19% вместо 5,66%, извлекаемых этиловым спиртом. Эти данные наряду с данными Херда и Амоса показывают, что извлечение липидов из отрубей этиловым спиртом не является полным. Салливэн и Ниэр отмечают, что экстракция отрубей этиловым спиртом должна продолжаться в течение ночи вместо 2 часов, достаточных для экстракции других продуктов помола. Микроскопическое исследование, в свою очередь, показало, что слой семенной оболочки зерна окрашивается жировыми красителями даже после 16-часовой экстракции отрубей смесью бензол — спирт в аппарате Сокслета.
Как установлено при использовании водонасыщенного н-бутилового спирта для аналитических целей, этот растворитель по сравнению с неполярными растворителями имеет тот недостаток, что он извлекает большее количество веществ нелипидной природы. Однако в некоторых случаях при исследовании липидов в продуктах переработки пшеницы он может иметь определенные преимущества. Установлено, например, что если липиды муки распределялись между петролейным эфиром и 50%-ным водным этиловым спиртом, оказывалось, что липиды, извлекаемые при комнатной температуре водонасыщенным н-бутиловым спиртом, находились по большей части в 50%-ном этиловом спирте. Такое распределение заметно отличалось от распределения липидов, извлекаемых горячим этиловым спиртом. Эти наблюдения подтверждают, что липиды муки встречаются в форме, сравнительно хорошо растворимой в полярных растворителях; она сохраняется при извлечении н-бутиловым спиртом, но изменяется при извлечении горячим этиловым спиртом. Тсен, Леви и Глинка использовали метод быстрого извлечения липидов из животных тканей при исследовании продуктов переработки пшеницы. Опытный образец подвергали кратковременной начальной экстракции смесью хлороформа, метилового спирта и воды при комнатной температуре; чтобы вызвать разделение фаз, добавляли дополнительное количество хлороформа и воды, и после центрифугирования липиды извлекались из хлороформного слоя. В этом случае получали значительно больше липидов, чем при извлечении петролейным эфиром, но несколько меньше, чем при экстракции водонасыщенным н-бутиловым спиртом, при длительной экстракции этиловым спиртом или в случае кислотного гидролиза. Предложенный метод имеет преимущество быстрой регенерации липидного материала, что позволяет свести к минимуму возможность порчи липидов. Кроме того, этот метод может быть использован для извлечения липидов непосредственно из теста без предварительного его высушивания. Липиды из клейковины достаточно хорошо извлекаются с помощью водного ацетона; в этом случае их выход составляет 12% и более. Фишер, Ричи и Коппок использовали этот растворитель для экстракции муки, хлеба и теста без предварительного высушивания образцов. Даниэльс, Центнер и Блоксма использовали водный ацетон в исследованиях по изучению влияния отделения липидов на образование клейковины в опытах по выделению липопротеидов.
Для извлечения липидов из продуктов переработки пшеницы использовались и другие обычные жировые растворители. В большинстве случаев полученные результаты были средними между результатами, полученными с помощью петролейного эфира, с одной стороны, и при обработке образцов спиртом и ацетоном — с другой. Каких-либо широких сравнений не было проведено ни на одном из упомянутых образцов, однако представленные ниже данные являются, по-видимому, довольно типичными.
Муку экстрагировали перколяцией при комнатной температуре из расчета 500 мл растворителя на 200 г муки и количество полученного растворимого в петролейном эфире материала выражали в процентах от сухого веса муки.
Петролейныи эфир, фракция 40—60° … 1,01
Четырех хлористый углерод 1,05
Бензол 1,13
Этиловый эфир 1,13
Хлороформ 1,33
Этиловый спирт 1,54
При выдерживании на свету липиды муки самоокисляются и обесцвечиваются, причем в хлороформе и, особенно в четыреххлористом углероде быстрее, чем в других растворителях. Для полной и быстрой экстракции более полярных липидных соединений совершенно обязательным является присутствие воды; на это указывают результаты опытов с ацетоном и спиртами — метиловым, этиловым и н-бутиловым. По данным Тсена, Леви и Глинки, для эффективного извлечения липидов было необходимо присутствие в исходной смеси растворителей около 17% воды.
В случае с неполярными растворителями содержание влаги при экстракции также является немаловажным фактором, что установлено с помощью методов, рекомендованных Ассоциацией агрохимиков, путем определения количества неочищенного (сырого) жира, которое может быть извлечено при экстракции высушенного образца безводным эфиром. Присутствие влаги оказывает влияние и на состав экстракта муки, особенно на состав его белковой части при обработке муки четыреххлористым углеродом.
Аналогичным образом влажность ячменя или пшеницы оказывала влияние на содержание азота и фосфора в экстрактах, полученных с помощью петролейного эфира. Этот фактор не всегда учитывался при исследовании состава липидов пшеницы, выделенных при помощи неполярных растворителей.