Выведение лучших инбредных линий не было очень эффективным приемом.
Получаемые в производстве гибриды кукурузы во всем мире связаны с относительно небольшим числом инбредных линий. Эти немногие элитные инбредные линии дали буквально миллионы гибридных комбинаций. Вывести инбредные линии, определенно превышающие по всем признакам лучшие из ныне существующих, становится все труднее, так как пренебрегались методы улучшения селекционируемых популяций.
Линдстром высказал недовольство плохими фенотипическими признаками инбредных линий, полученных путем непрерывного самоопыления с отбором среди потомства самоопыленных початков. Он подсчитал, что в предыдущие пять лет было выделено по меньшей мере 100 000 инбредных линий. Каждая из этих инбредных линий, помимо низкой урожайности, была серьезно дефектной по одному или нескольким признакам. Генетически он предполагал, что по крайней мере четыре фактора ответственны за неудачи в получении крайне мощных инбредных линий: очень большое число генов; непредвиденное влияние внешней среды в программах отбора; сложное и запутанное взаимодействие генов; отсутствие метода выделения подобных линий.
Большинство ныне используемых инбредных линий было выведено путем отбора внутри и между самоопыляемыми линиями. С этой целью использовались стандартный и гнездовой методы. Для получения гомозиготных диплоидов можно использовать удвоение числа хромосом моноплоидов (гаплоидов).
Стандартный метод. Стандартный метод выведения инбредных линий обычно заключается в отборе растений в период инбридинга на основании внешнего вида рядка растений, выращенных из одного и того же початка. Этот метод оказался эффективным в получении инбредных линий. Действительно, большинство современных гибридов получено от скрещивания инбредных линий, выведенных при помощи стандартного метода.
Приводимый ниже пример типичен для этого метода.
Первый год. Самоопыление нескольких сот или более отобранных растений желательных свободноопыляющихся сортов, синтетиков или гибридов. Растения и початки, неудовлетворительные по внешнему виду, выбраковывают.
Второй год. От каждого самоопыленного початка выращивают в рядке 10—30 растений. В каждом рядке самоопыляются 3—5 желательных растений. Между потомствами разных початков и в пределах потомства одного початка проводят отбор. Собирают початки с 1—3 лучших растений каждого отобранного рядка.
Третий год. От одного до трех початков каждой отобранной семьи высевают отдельными рядками (початкорядно). Лучшие растения самоопыляются. В каждой семье на основании внешнего вида растения отбирают лучший рядок. Остальные рядки выбраковывают. Сохраняют по 1—3 лучших початка от желательных растений отобранного рядка. Этот прием повторяют до тех пор, пока каждая инбредная линия не станет относительно гомозиготной (5—7 лет).
Оценка инбредных линий в анализирующих скрещиваниях может быть начата в первых поколениях инбридинга или отложена до тех пор, пока семьи не станут относительно гомозиготными. Потомства 10—30 растений дают возможность проводить отбор в пределах субсемей и между ними. Однако удается оценить лишь ограниченное количество материала, и процент выхода желаемых линий низкий.
Гнездовой метод. Гнездовой метод сходен со стандартным, за исключением того, что из каждого початка выращивают 3—4 растения в одном гнезде. Этот метод был предложен Джонсом и Синглтоном. Синглтон и Нельсон несколько усовершенствовали эту методику. Этот метод был использован на Иллинойсской опытной станции для выведения многих инбредных линий. Однако этот метод использовался лишь немногими селекционерами кукурузы, а наиболее прямые и четкие доказательства его возможной ценности были получены Югенхеймером.
Югенхеймер провел прямые сравнения гнездового и стандартного методов выведения инбредных линий кукурузы. Гнездовым способом были высеяны 300 отобранных початков. Для моделирования стандартного метода 60 случайно выбранных из них початков выращивали делянками по 5 гнезд. Таким образом, при каждом методе выведения инбредных линий использовалось одинаковое число растений. По два растения из каждого гнезда подвергали самоопылению, а также скрещивали с соседним контрольным простым гибридом для получения данных о специфической комбинационной способности. Для этой цели можно было использовать подходящую инбредную линию.
Трехлинейные гибриды с участием выведенных при помощи стандартного метода инбредных линий дали от 425 до 875 г зерна на гнездо, что составило 10 классов вариационного ряда. Селекционеры кукурузы в основном заинтересованы лишь в лучших линиях. Два процента линий дали урожай не менее 825 г на гнездо. Урожайность материала, полученного гнездовым методом, составила от 375 до 925 г на гнездо, что составило 12 классов вариационного ряда. При этом гнездовой метод дал 6% элитных линий, что в 3 раза превышает результаты стандартного метода. Все полученные гнездовым методом элитные линии были неродственными, и их можно было использовать в промышленных гибридах, тогда как многие из полученных стандартным методом элитных инбредных линий оказались родственными субсемьями и не могли использоваться в одних и тех же гибридах.
Модальным классом является урожай 625 г, но для субсемей объем этого класса вдвое меньше. Некоторым селекционерам приходится испытывать столь большое число семей, что они объединяют субсемьи и проводят одно испытание для всей семьи. Испытание смеси всех субсемей обычно не дает возможности выявить лучшие инбредные линии. Результаты попарного объединения субсемей из гнездового материала показаны в правом верхнем углу схемы. Гнездовой метод приводит к выявлению 4% лучших линий, не обнаруживаемых при стандартном методе. Аналогичные результаты были получены в 1948 и 1949 гг.
Проверка сублиний поколения S1 в гибридных комбинациях на ранних стадиях выведения инбредных линий была проведена Югенхеймером в 1946 и 1947 гг. Для каждой из семи семей 5 сублиний и их смесь были скрещены с WF9 X Hy. Каждой семье был присвоен номер.
Урожайность тестера (контрольного гибрида) составляла 19 фунтов зерна на делянку. Средняя урожайность для семей колебалась от 16 до 18 фунтов на делянку. Ни один из этих гибридов не превысил по урожайности тестер. Однако испытание субсемей привело к выявлению щести неродственных инбредных линий, которые по урожаю были равны или превышали тестер. Урожайность сублиний семьи 8 варьировала от 14 до 20 фунтов на Делянку. Все сублинии семьи 7 были низкоурожайными, тогда как все сублинии семьи 4 давали хороший урожай.
Процент неполегающих растений ко времени сбора урожая трехлинейных гибридов для разных сублиний варьировал от 10 до 90. Процент таких растений в семьях 2 и 4 достигал 70, тогда как во всех сублйнйях семьи 8 он был равен в среднем лишь 48%. Процент неполегающих растений в сублиниях семьи 7 колебался от 30 до 90.
Результаты анализирующих скрещиваний показывают, что гнездовой Метод выведения инбредных линий был более эффективным для переопыления, чем обычно использовавшийся селекционерами стандартный метод. Некоторые исследователи проводят испытание новой инбредной линии на смеси початков семьи. Подобные испытания обычно приводят к неудачам по выявлению лучшей сублинии в расщепляющейся популяции. Эффективность стандартного метода была значительно повышена путем оценки отдельных растений субсемей в анализирующих скрещиваниях на первых этапах инбридинга. Многие из лучших инбредных линий были бы выбракованы, если бы смешивали початки разных сублиний и проводили лишь одно испытание на семью. Испытания могут быть задержаны или начаты на ранних стадиях инбридинга. На Иллинойсской опытной станции было доказано, что гнездовой метод является приемлемым методом для кукурузы, зерновых культур и сои.
Гнездовой метод выведения инбредных линий может быть эффективно использован при периодическом, реципрокном периодическом, гаметическом и других типах отбора. Этот метод ограничивает отбор преимущественно различиями между семьями. Экспериментально показано, что различия между семьями значительно больше, чем внутри семей. Этот метод дает возможность с малой затратой труда проверять большое число семей, так как позволяет выращивать в 10 раз больше семей, чем стандартный метод. Очевидно, что при желании можно вырастить большее число растений каждой линии. Этот метод является очень эффективным при сочетании с соответствующей программой испытания.
Удвоение хромосом у гаплоидов. Выделение гаплоидных растений кукурузы генетическими методами было предложено Рандольфом. Усовершенствования и оценки этих методов были предложены Чейзом, Александером, Форд, Ко и др., Петерсоном и Вернсманом, Горслайном и др., Нанда и др. и Кермайклом (1969 г.)
Моноплоид (также именуемый гаплоидом) является индивидуумом, содержащим половину нормального набора хромосом. Это спорофит, содержащий один геном на клетку.
Некоторые селекционеры кукурузы заинтересовались получением инбредных линий путем удвоения числа хромосом гаплоидного растения. Чейз описал соответствующую методику. Исходным материалом может быть гибрид, синтетик или свободноопыляющийся сорт.
Растения опыляют пыльцой генетически маркированной линии, характеризующейся пурпурной окраской алейрона и растения. Нормальные семена потомства такого скрещивания образуют пурпурный алейрон, а диплоидные растения потомства имеют пурпурную окраску различных частей растения. Алейроновый маркер используется для выявления засорения чужой пыльцой. Желтые зерна, выбраковывают как возможный результат самоопыления или перекрестного опыления. Растения, развивающиеся из пурпурных семян, но не имеющие пурпурной окраски, — предполагаемые гаплоиды. Дальнейшее выявление истинных гаплоидов в этой относительно небольшой группе проводят путем подсчета хромосом и по внешнему виду зрелых растений.
Гаплоидные растения обычно слабые, мелкие и высокостерильные. Их частота сильно варьирует от 1:1500 до примерно 1:27. Пурпурная окраска маркированных проростков обнаруживается также в их корешках. Следовательно, генетическую классификацию по окраске растения можно проводить на лотках для проращивания в первые 5—10 дней. Непурпурные проростки из пурпурных семян переносят на поле или в теплицу и выращивают до зрелости. Все образующие пыльцу растения самоопыляются.
Успешность размножения самоопыленных растений может быть повышена обработкой гаплоидов колхицином. Этот прием включает инъекцию слабого раствора колхицина в скутеллярные узлы предполагаемых гаплоидов, как только последние распознаются. Обработка колхицином обычно приводит к получению самоопыленного потомства приблизительно у одного гаплоида из пяти.
Для повышения успешности воспроизведения гаплоидов могут использоваться генетические методы. Чейз установил, что производные гаплоидных линий являются особенно ценным источником субфертильных гаплоидов.
Гаплоиды являются ценными формами для физиологических исследований и цитогенетического изучения. Поскольку удвоение числа хромосом у гаплоидов приводит к образованию полностью гомозиготной популяции, любая изменчивость между растениями должна быть обусловлена мутациями или влиянием условий окружающей среды. Эти популяции были бы ценным материалом для радиационных исследований.
Чейз указал, что гаплоиды могут использоваться для цитологического исследования мейотического распределения неконъюгирующих хромосом, негомологичных синаптических отношений хромосом и механизмов удвоения хромосом; в генетике они могут использоваться для прямого наблюдения мутационных эффектов, определения скорости мутации, изучения влияния цитоплазмы и для биохимических исследований; в области сельского хозяйства их можно использовать для получения гомозиготных диплоидных линий непосредственно из гаплоидов.
Целесообразность использования этой системы в селекционной программе зависит от относительной стоимости или эффективности удвоения хромосом гаплоидов по сравнению с обычным самоопылением, фенотипических и генотипических признаков инбредных линий по сравнению с линиями, выведенными обычным способом.
Частота возникновения и фертильность гаплоидов для некоторых линий очень низки. По-видимому, самоопыляющиеся сорта создают больше затруднений, чем гибридный материал. Метод гаплоидов является, по существу, отбором гамет в самом строгом смысле слова. Успешное удвоение хромосом приводит к фиксации отдельной гаметы, которая может воспроизводиться в будущем. Этот метод похож на позднее испытание, в котором выводимая линия не проверяется на комбинационную способность с другими инбредными линиями до тех пор, пока она не станет гомозиготной.
Форд изучала частоту встречаемости аномальных особей в потомстве гаплоидов в результате абортирования пыльцы и мейотических аномалий. Она установила, что аутодиплоидные линии и другие производные гаплоидов не являются в большей степени мейотическими аберрантами, чем линии, полученные в результате инбридинга. Относительный эффект естественного отбора гаплоидного спорофита не сравнивали с отбором, проводимым селекционером в расщепляющихся популяциях самоопыленного материала. Однако гаплоиды должны нести хорошо сбалансированные генетические системы, так как прохождение спорофитной стадии в гаплоидном состоянии связано с жесткой отбраковкой летальных и сублетальных генов.
Александер указал, что линии, полученные путем удвоения хромосом у гаплоидов, гомозиготны по всем локусам. Этот процесс значительно сокращает время, необходимое для получения инбредных линий; отбор на высоко желаемые генетические комбинации может проводиться более эффективно на гаметической основе, чем на зиготической. Особи, несущие вредные гены, элиминируются, так как гаплоидный спорофит подвергается интенсивному естественному отбору. Однако метод выделения гаплоидов сложен и утомителен, жизнеспособную пыльцу образует не более 20—30% обработанных гаплоидных растений, немедленная фиксация генотипа уменьшает возможности отбора, а отбор на основе гамет может не иметь столь большого значения для получения инбредных линий с лучшими свойствами, как отбор на основе зигот. Этот метод заслуживает внимания, так как позволяет выводить гомозиготные инбредные линии для специальных целей.
Метод множественной транслокации или метод энотеры. Метод множественной транслокации или метод энотеры для выведения инбредных линий был предложен Бернхэмом. Предложенный метод использует транслокации таким образом, что F1 от скрещиваний с нормальными линиями в мейозе образует хромосомные кольца, содержащие полный диплоидный набор хромосом. Такое растение дает два типа функционирующих спор, соответствующие двум родительским гаметическим комбинациям хромосом. Остальные комбинации у кукурузы абортируются. Если летальные гены отсутствуют, потомство от самоопыления таких растений состоит из гетерозигот с хромосомными кольцами, распознаваемыми по значительному абортированию пыльцы, и двух типов нормальных растений, гомозиготных по одной из двух родительских гаметических комбинаций. Эти два типа нормальных растений будут обладать нормальной пыльцой и нормальным числом пар хромосом и могут быть, распознаны по скрещиванию со стандартными нормальными линиями. Нормальная не несущая транслокаций форма образует гомозиготную инбредную линию.
Вероятность выделения лучших инбредных линий при этом равна частоте, с которой в гетерозиготной популяции образуются высококачественные гаметы.
Бернхэм предположил, что эта методика могла бы быть улучшена несколькими способами. Можно избежать некоторых из проверочных скрещиваний, если в линию с множественными транслокациями включены генетические маркеры. Эти маркеры помогли бы распознать и исключить большинство гомозиготных по транслокациям растений F2. Гомозиготные и гетерозиготные по транслокациям растения можно было бы распознать при введении доминантных маркеров. В этом случае требовалось бы проверять лишь нормальные аллели на стерильность пыльцы. Остальные нормальные растения подвергались бы проверочным скрещиваниям.
Этот метод выведения инбредных линий был предложен на основании теории и не проверялся. Ричи задал вопрос, не может ли немедленно достигнутая гомозиготность оказаться невыгодной в связи с фиксацией вредных рецессивов, прежде чем они могут элиминироваться отбором. Маколей обнаружил, что самоопыление может очень быстро приводить к гомозиготности, что не дает возможности получить лучшие результаты.