Впервые количественное определение выживаемости микроорганизмов в заданных условиях влажности было проведено на бактериальных культурах, высушенных в аэрозоле: Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus subtil is, Klebsiella pneumoniae (Webb, 1961, 1966; Cox, 1968; Maltman, Webb, 1971). M. E. Бекер и др. (1965, 1972) определяли выживаемость дрожжей Torulopsis utilis и Candida tropicalis и получили ксерограммы. Это позволило рекомендовать оптимальный режим высушивания биомассы дрожжей.
Такой же методический прием мы использовали при изучении действия обезвоживания на некоторые виды семейства Dematiaceae, учитывая, что в природных условиях повышенную сухость воздуха и субстрата способны переносить покоящиеся структуры: склероции, споры, хламидоспоры грибов, а у многих гифомицетов — конидии (Ячевский, 1938; Leach, Scott, 1959; Великанов, 1980). В нашей работе было испытано влияние различных значений ОВВ (100, 90, 80, 60, 30, 15, 5 и 0%) на сформировавшиеся, нормально спороносящие колонии представителей семейства Dematiaceae; Stemphylium ilicis, Curvularia geniculata. Oidiodendron cerealis, Humicola grisea, Cladosporium transchelii и три его мутанта Ч-1, К-1 и БМ, различающиеся по степени пигментации. Исследование проводили по методу Taha-Ezz, Sharabash. Высушиванию подвергали сформировавшиеся, обильно спороносящие культуры, продолжительность пребывания их в заданных условиях составила 30 суток. При этом эффект «дорастания» не мог оказать влияния на достоверность полученных результатов. Зависимость выживаемости видов от значения ОВВ окружающей среды выражали в виде ксерограммы. У всех изученных грибов в условиях 50—60% ОВВ выживаемость снижалась, что совпадает с результатами упомянутых выше авторов. Исключение составлял мутант К-1, у которого максимальное падение выживаемости наблюдалось при ОВВ 90—80%.
Необходимо отметить, что оптимальными для выживаемости были высокая (95—90%) и низкая (30—0%) ОВВ. Выживаемость непигментированных мутанта БМ и Penicillium lilacinum в основном не отличалась от таковой испытанных видов. Изученные виды грибов по устойчивости к условиям влажности распределились в основном в соответствии с исходной электронно-акцепторной емкостью их меланиновых пигментов, показателем которой является концентрация парамагнитных центров (ПЦ) меланина в пересчете на 1 г сухой грибной пленки. Ранее мы показали, что парамагнитные свойства темноцветного гриба Cladosporium transchelii связаны с меланиновым пигментом, причем с повышением содержания его концентрация ПЦ, а следовательно, и интенсивность сигнала ЭПР увеличивалась (Жданова, Походенко, 1970). На основании выявленной зависимости можно было сделать вывод о защитной роли меланинового пигмента грибной клетки при высушивании. Для проверки последнего изучали кинетику сигнала ЭПР меланинового пигмента in vivo (в грибной клетке) и на изолированном пигменте. Из колоний грибов, выращенных в обычных условиях и затем выдержанных в течение 30 суток в определенных условиях влажности, отбирали образцы, которые помещали в вакуум-эксикатор и высушивали в течение 72 ч до постоянной массы.
Зависимость содержания ПЦ от влажности воздуха у темнопигментированных гифомицетов и мутантов Cladosporium transchelii выражалась сложными параболическими кривыми с максимумами при ОВВ 60—30%. Исключение составлял мутант С. transchelii К-1, у которого максимальное увеличение сигнала ЭПР наблюдали при ОВВ 80%. Установлено, что условиям влажности, наименее пригодным для выживания, соответствовало максимальное содержание ПЦ. Ранее нами было показано, что возрастание концентрации ПЦ связано с повышением электронно-донорной функции меланинового пигмента, а ее снижение — с повышением электронноакцепторной функции. Так как выживаемость микроорганизмов при разных режимах влажности обусловлена неодинаковыми причинами, меланиновый пигмент как защитное вещество должен по-разному реагировать на эти обстоятельства (Hess, 1965; Webb, 1967). С понижением ОВВ от 100 до 60—50% происходит постепенное удаление из клетки свободной и связанной воды. Меланиновый пигмент, по нашим наблюдениям, в указанном режиме влажности проявляет электронно-донорную способность. Понижение ОВВ от 50 до 0% способствует быстрому высушиванию клеток, приводящему к значительному изменению проницаемости клеточных мембран из-за удаления большей части связанной воды. При этом меланиновый пигмент проявляет преимущественно электронно-акцепторную функцию. Кроме того, мы подтвердили известные в литературе сведения о губительном действии кислорода на сухие клетки. Так, с понижением ОВВ от 90 до 50% выживаемость конидий Cladosporium transchelii, высушенных в кислороде, уменьшалась по сравнению с таковыми, высушенными в воздухе, примерно в 2,5—3 раза, а при ОВВ 30 и 15% — в 4,5 и 12 раз.
Было проведено сравнительное изучение выживаемости и кинетики сигнала ЭПР при высушивании (0% ОВВ) Cladosporium transchelii и крайних по степени пигментации мутантов Ч-1 и БМ в условиях кислородной, воздушной, азотной атмосферы и вакуума. Наиболее чувствительным к высушиванию оказался апигментный мутант БМ, на котором ингибирующее действие кислорода проявилось в максимальной степени. Напротив, выживаемость пигментированных конидий Cladosporium transchelii практически не изменялась в кислороде и у мутанта Ч-1 по сравнению с контролем (выживаемость в воздухе) заметно увеличивалась. В отсутствие кислорода в окружающей среде выживаемость конидий пигментированных штаммов была значительно выше, чем в контроле. Исключение составляли конидии мутанта БМ, для которого высушивание в условиях вакуума оказалось неблагоприятным. Концентрация ПЦ меланиновых пигментов С. transchelii и Ч-1 с уменьшением кислорода в воздушной среде увеличивалась.
Отсутствие ингибирующего действия кислорода на выживаемость пигментированных конидий, по всей вероятности, обусловлено антиоксидантным действием меланинового пигмента. У апигментного мутанта такой эффект отсутствовал.
Изучение изолированного пигмента, выделенного из гриба Cladosporium transchelii в различных условиях влажности проводили в капиллярах на шлифах. Во всех опытах отмечалась линейная зависимость содержания ПЦ меланинового пигмента от ОВВ, с повышением влажности концентрация ПЦ уменьшалась.
Об участии меланинового пигмента в защите грибной клетки от повышенной сухости окружающей среды судили также на основании экспериментов, выполненных на модельной системе — водный раствор меланинового пигмента и конидии апигментного мутанта Cladosporium transchelii БМ. Конидии указанного мутанта в 0,01%-ном растворе меланинового пигмента помещали на покровное стекло: выживаемость конидий по сравнению с контролем (конидии в воде) определяли после 48-часового пребывания в условиях заданной влажности. Во всех случаях выживаемость конидий мутанта БМ в опыте превышала таковую в контроле. Особенно четко защитный эффект проявлялся при абсолютной (0%) сухости воздуха. Выживаемость конидий в растворе меланинового пигмента увеличивалась почти в 20 раз, тогда как при ОВВ 60—80% — примерно вдвое. Кроме того, о защитном действии меланинового пигмента свидетельствовали результаты эксперимента, в котором на гриб одновременно действовало два неблагоприятных фактора: обезвоживание и γ-радиация. Высушенные в разных условиях влажности грибные пленки переносили в отростки пробирок Тунберга, на дно которых наливали 15 мл серной кислоты соответствующей концентрации. Образцы выдерживали 24 ч для стабилизации заданного режима влажности и облучали заранее установленной для каждого гриба дозой γ-излучения — на уровне ЛД90. Зависимость радиоустойчивости пигментированных культур от режима влажности характеризовалась дугообразной кривой с максимумом при ОВВ 40—60%. Характер полученных кривых в основном совпадал с таковым кривых изменения содержания ПЦ меланинового пигмента в этих же условиях. Ранговый коэффициент, характеризующий степень сопряженности процессов кинетики ПЦ и радиоустойчивости для видов Stemphylium ilicis, Cladosporium transchelii Ч-1 и Cladosporium transchelii составлял 0,65; 0,70; и 0,79 соответственно, т. е. был достоверным. Радиорезистентность непигментированных мутанта БМ и Penicilium lilacinum изменялась в соответствии с выживаемостью в изученном режиме влажности.
У грибов с высоким содержанием меланина наибольшая устойчивость к γ-излучению наблюдалась в условиях «критической» влажности (40—60% ОВВ), что согласуется с ранее установленной зависимостью γ-устойчивости темноцветных грибов от концентрации ПЦ этого пигмента. Последнее может свидетельствовать о том, что меланиновый пигмент участвует в защите грибной клетки как от высыхания, так и от γ-излучения.
Таким образом, в процессе сравнительного изучения влияния заданных условий влажности на выживаемость, радиоустойчивость и кинетику ПЦ меланиновых пигментов грибов, различающихся по степени пигментации, удалось показать участие меланинового пигмента в явлении ксероустойчивости.
В сообщениях ряда авторов содержатся сведения о гибели микробных клеток в экстремальных условиях сухости под воздействием кислорода (Hess, 1965; Webb, 1967). С помощью методов биохемолюминесценции и сверхслабого свечения (Веселовский и др., 1975; Хекли, 1979) в высушенных клетках растений обнаружили повышенное содержание высокоактивных форм кислорода — синглетного кислорода и супероксидного ион-радикала, приводящих к образованию свободных радикалов. Математическая модель кислородного поражения клеток (Strange, Cox, 1976) предусматривает возможное существование в клеточных оболочках акцепторов, реагирующих с активированным кислородом по типу тушения его высокоактивных форм. Совокупность полученных нами экспериментальных данных дает основание полагать, что защитная реакция меланинового пигмента в условиях повышенной сухости окружающей среды осуществляется аналогичным образом. Известно, что длительное хранение при крайне низких значениях ОВВ приводит к значительному отмиранию микроорганизмов, что является существенным недостатком при их хранении (Бекер, 1967).
Пребывание в течение 30 сут при 5—0%-ной ОВВ Penicillium lilacinum, мутанта С. transchelii БМ, не имеющих меланинового пигмента, и Oidiodendron cerealis, с меланиновым пигментом низкого содержания ПЦ, приводило к снижению выживаемости конидий (до 10—0,07%). В то же время выживаемость видов, обладающих меланиновым пигментом с высоким содержанием ПЦ, (1 ∙ 108 и выше), в ряде случаев была выше, чем в контроле, по-видимому, вследствие максимального прорастания конидий. Мы специально изучали влияние длительного хранения при ОВВ 0% на выживаемость, концентрацию ПЦ меланинового пигмента и радиоустойчивость конидий Cladosporium transchelii. Контролем служили выживаемость, радиоустойчивость и величина сигнала ЭПР меланина в грибной пленке, высушенной в вакуум-эксикаторе в течение 72 ч.
Выживаемость конидий С. transchelii уменьшалась до 60% только после 30-дневного пребывания в экстремальных условиях влажности, через 6 месяцев значение ее было близким к выживаемости в контроле; она несколько снижалась (75%) после 11 месяцев хранения. О защитном действии меланина свидетельствует постепенное уменьшение сигнала ЭПР на протяжении первых трех месяцев хранения гриба. После этого срока интенсивность сигнала повышалась и к концу хранения достигала максимума, что может быть связано с постепенной деструкцией пигмента. Радиоустойчивость конидий на протяжении времени хранения практически не изменялась.
Рассмотренные выше физиолого-биохимические нарушения, сопровождающие процесс высушивания клетки, и некоторые аспекты предположительного механизма защитного действия меланинового пигмента свидетельствуют о его участии в защите темноокращенных биологических объектов в условиях пониженной ОВВ, но при нормальном атмосферном давлении. Это послужило основанием для проведения соответствующих экспериментов в условиях сверхвысокого вакуума.
Литература, посвященная действию вакуума на бактериальные и грибные объекты, малочисленна. Толчком к развитию исследований в этом направлении послужили успехи в экзобиологии и освоении космического пространства. Первые сообщения касались главным образом выживаемости ряда бактериальных и грибных спор после экспонирования их в условиях глубокого вакуума (Portner et al., 1961; Morelli, 1962; Silverman et al., 1967). Выживаемость Bacillus subtilis var. niger была чрезвычайно высокой, после 35 дней пребывания спор в вакууме она составляла 50% (Morelli, 1962). По данным А. А. Имшенецкого и соавт. (Imshenetsky et al.), 3-суточная экспозиция в вакууме не была губительной почти для 50% клеток Micrococcus luteus и М. aurantiacum. Значительно менее устойчивыми оказались дрожжи, особенно Rhodotorula rubra и Zygosaccharomyces vini (выживаемость 10 и 18% соответственно). Такая же экспозиция почти не влияла на выживаемость, интенсивность дыхания и активность железосодержащих порфириновых белков Nadsoniella nigra var. hesuelica (Имшенецкий и др., 1974). Среди изученных несовершенных грибов значительной резистентностью к глубокому вакууму отличались виды Aspergillus niger, A. terreus, а также Penicillium notatum, Papulaspora anomala, Circinella muscae (выживаемость от 100 до 75%), несколько менее устойчивым был Penicillium wortmani (51%) и достаточно чувствительным Trichothecium roseum (8,5%) (Imshenetsky et al., 1966, 1977). Особенности влияния сверхвысокого вакуума на клетки Escherichia coli и Bacillus subtilis var. niger изучал Bucker (1972, 1976). Максимальная инактивация бактерий наблюдалась в период удаления воды из клеток. В результате нарушалась проницаемость клеточных мембран, наблюдался выход из клетки нуклеиновых кислот, увеличивалась чувствительность организма к ионизирующему и УФ-излучению, снижалась его терморезистентность, при освещении не происходило ферментативного фотовосстановления и восстановления за счет выщепления димеров ДНК.
Мы изучали грибы семейства Dematiaceae (порядок Hyphales): Cladosporium transchelii, три его мутанта Ч-1, К-1 и БМ, различающихся содержанием меланинового пигмента, Stemphyllium ilicis и S. sarciniforme. Образцы грибных конидий для обработки в условиях сверхвысокого вакуума приготовляли по разработанной нами методике (Жданова и др., 1978). Критерием устойчивости к действию сверхвысокого вакуума (1 ∙ 10-4 Па) служила выживаемость конидий в процентах к необработанному контролю.
Установлена достаточно высокая выживаемость видов Stemphylium ilicis и S. sarciniforme в вакууме. Графически она описывалась кривой сигмоидного типа с обширным плечом резистентности. Снижение выживаемости отмечалось только после 48—72-часового пребывания конидий в вакууме, после 8 сут экспозиции она достигала 7—10%. Анализ полученной дозовой зависимости свидетельствует о том, что указанные виды могут перенести значительно более длительную экспозицию, о чем свидетельствует единовременный опыт 47-суточного экспонирования конидий рода Stemphylium: 3—5% конидий оказались способными к прорастанию и образованию макроколоний.
Кинетика сигнала ЭПР меланинового пигмента была однотипной. Существенные изменения в концентрации ПЦ происходили в течение первых 24 ч, затем процесс стабилизировался. На фоне относительной стабилизации парамагнитного состояния меланинового пигмента, которое наблюдалось на протяжении 8 сут экспозиции в вакууме, наблюдали постепенное снижение выживаемости изученных штаммов рода Stemphylium. С помощью метода ЯМР (ядерного магнитного резонанса) установлено достаточно высокое содержание подвижной изолированной воды (8 и 12%) в конидиях рода Stemphylium.
Зависимость выживаемости Cladosporium transchelii и его цветных мутантов от времени пребывания в вакууме описывалась сигмоидной кривой для пигментированных культур и экспоненциальной — для апигментного мутанта БМ. Исходная культура Cladosporium transchelii и мутанты Ч-1 и К-1 на протяжении 48 ч экспонирования в вакууме по выживаемости достоверно не различались. С увеличением экспозиции у мутанта К-1 наблюдалось резкое уменьшение выживаемости до 0,06% к 8 сут. Наибольшей чувствительностью отличались конидии мутанта БМ, для них 2-суточное пребывание в вакууме оказалось сублетальным. Эти данные предположительно свидетельствуют об участии меланинового пигмента в устойчивости изученных грибов к этому фактору. Отмечено, что количество подвижной изолированной воды в конидиях с уменьшением степени пигментации культур увеличивалось. Так как на определение количества подвижной изолированной воды влияет присутствие жиров в клетке (от 8% и выше), учитывали общее содержание жиров у изученных грибов. Оно колебалось от 3 до 8%, что обусловило достоверность полученных данных.
Характер изменения интенсивности сигнала ЭПР меланина С. transchelii и его пигментных мутантов под влиянием вакуума напоминает таковой для видов рода Stemphylium. Концентрация ПЦ меланина С. transchelii и мутанта Ч-1 в период от 24 ч до 8 сут наблюдения приближалась к контрольному значению, а у светлоокрашенного мутанта К-1 после 4 сут и далее до 8 сут на 20% превышала контрольное.
Ранее нами была определена выживаемость темнопигментированных грибов в условиях разного режима влажности — от 100 до 0% ОВВ. Установлено, что она зависела от степени пигментации и у культур с высоким содержанием меланина не уступала контролю даже при отсутствии водных паров в воздушной среде (0% ОВВ). Эти данные послужили основанием для дальнейшей работы с целью изучения устойчивости грибов S. ilicis, S. sarciniforme, С. transchelii и его мутантов к влиянию сверхвысокого вакуума. К сожалению, затруднительно сравнить полученные нами данные по выживаемости в условиях вакуума с известными в литературе. В немногочисленных работах подобного рода данные получены после непродолжительных и большей частью одноразовых экспозиций. В некоторой степени такое сравнение возможно с работами А. А. Имшенецкого и др. (Imshenetsky et al., 1966, 1977), в соответствии с которыми выживаемость изученных нами видов рода Stemphylium после 3 сут пребывания в вакууме приближалась к таковой Aspergillus terreus. Выживаемость исходной культуры С. transchelii и его пигментных мутантов Ч-1 и К-1 составляла 30%, что значительно выше выживаемости, например, Trichothecium roseum.
Определение подвижной изолированной воды у культур С. transchelii и его мутантов показало, что количество ее увеличивалось с уменьшением содержания меланинового пигмента, о котором судили по концентрации ПЦ 1 г сухой биомассы. Количество ее у мутантов Ч-1 и БМ составляло соответственно 4 и 14%. В то же время выживаемость мутанта К-1, отличающегося пониженным содержанием меланина, но достаточно высоким — подвижной изолированной воды (8%), на протяжении 4 сут высушивания достоверно не отличалась от. таковой исходной культуры и мутанта Ч-1. Устойчивые к действию вакуума виды рода Stemphylium, кроме высокого содержания меланинового пигмента, отличались значительным количеством подвижной изолированной воды. По-видимому, присутствие подвижной изолированной воды может оказывать защитное действие на клетку при высушивании (Аксенов, 1973).
Таким образом, мы попытались выяснить значение двух факторов: меланинового пигмента и подвижной изолированной воды, которые, по нашему мнению, могут участвовать в устойчивости изученных грибов к действию сверхвысокого вакуума. Получены первые сведения, касающиеся особенностей выживаемости изученных видов и мутантов темнопигментированных грибов в условиях экстремального высушивания, и высказано предположение о комплексной природе их устойчивости.
Источник: Н. Н. Жданова, А. И. Василевская. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте. Киев: Наук. думка, 1982