Наиболее часто для бактериологического исследования на бруцеллез отсылают абортированный плод (выкидыш) или его органы, реже плаценту, околоплодную жидкость или плодные оболочки, молоко (молозиво), содержимое полости рогов матки, гигром, абсцессов, слизь или выделения из влагалища.
Нередко направляют на исследования все внутренние органы, трубчатую кость и измененные лимфатические узлы убитых с диагностической целью животных на санитарных бойнях.
Плод. Наиболее полное бактериологическое исследование может быть произведено при обследовании цельного плода. В этом случае рост бруцелл на питательных средах получается, как правило, в чистой культуре, а засеянные среды могут выдерживаться в термостате до месяца без развития на них посторонней микрофлоры. Одновременно могут быть произведены посевы из цельного плода для исследования на другие инфекционные заболевания, в частности на вибриоз, паратифозный и вирусный аборты, листериоз и трихомоноз (для крупного рогатого скота). Плод должен отсылаться в водонепроницаемой таре, лучше в замороженном состоянии (в летнее время применять сухой лед). При отсутствии льда плод отсылают с нарочным, специально проинструктированным, с таким расчетом, чтобы он был доставлен в лабораторию не позже суток после аборта. В целях предупреждения рассеивания инфекции плод накрывают марлевыми салфетками, пропитанными 2%-ным раствором едкого натра, 2%-ным раствором фенола или другим дезинфицирующим раствором.
Вместо цельного плода могут быть отосланы его органы, например желудок (с преджелудками), селезенка, трубчатая кость, печень, почки, легкое. Чаще бруцеллы выделяются из содержимого желудка
и селезенки. Перед экстирпацией желудка перевязывают 12-перстную кишку и пищевод на расстоянии 10—15 см от желудка. При отсылке отдельных органов нужно соблюдать такие же предосторожности, как и при отправке плода.
Посев из абортированных плодов или их органов производят на плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА) без добавления в него красок. Могут быть сделаны посевы на косой агар в пробирки или в бактериологические чашки. Среды используют свежие в день их приготовления или давностью не более трех суток, выдержанные в холодильнике.
Посевы производят из содержимого сычуга (желудок), из селезенки, печени, костного мозга (трубчатая кость), легких, сердца (кровь), почек. Из сычуга и сердца посевы производят путем забора материала стерильной пастеровской пипеткой из глубины органа через фламбированный раскаленным шпателем участок ткани. Таким же образом засевают среды материалом из других органов, если ткань этих органов размягченная. Для засева материала из плотных тканей отбирают участки в местах локализации мелких белесоватых или желтоватых узелков или кровоизлияний, фламбируют шпателем, вырезают стерильным пинцетом кусочки массой 1—3 г, помещают в стерильную ступку с песком или в дробитель ткани, растирают в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и производят штриховые посевы.
Трубчатую кость распиливают поперек костной пилой, стерилизуют поверхность распила над пламенем спиртовки, пастеровской пипеткой берут из глубины костный мозг и делают штриховые посевы на средах.
Из каждого органа производят посевы на 2—3 чашки или засевают такое же количество пробирок. Из содержимого желудка телят и ягнят делают мазки на предметном стекле для окраски бруцелл по Козловскому или Граму. Для обнаружения вибрионов мазки лучше красить карболовым фуксином Циля, разведенным 1 : 5.
Ввиду возможной миграции Br. melitensis на крупный рогатый скот, а также в целях выделения некоторых биотипов Br. abortus следует производить культивирование засеянных пробирок или чашек в эксикаторах с пониженным содержанием кислорода и в обычных атмосферных условиях.
При культивировании посевов в микроанаэростатах дозирование углекислого газа осуществляют путем создания отрицательного давления, вследствие чего происходит засасывание в полость прибора нужного количества углекислого газа (10—15%). В обычных эксикаторах можно получить необходимое содержание СO2 путем сжигания в них ваты, но в данном случае эксикатор нужно загружать пробирками или чашками не более половины его вместимости. Крышки эксикаторов должны быть хорошо отшлифованы. Проверку их герметичности производят ежедневно в течение 6—8 дней культивирования и при необходимости герметичность восстанавливают. Посевы выдерживают в термостате при 37,5—38,5° С в течение 25—30 дней, хотя рост бруцелл в большинстве случаев обнаруживается на 3— 8-й день культивирования.
Матка. Истечения из матки абортировавшего животного берут для бактериологического исследования в первые дни после выведения плода. Для получения этого материала животное фиксируют, раскрывают влагалище влагалищным зеркалом с осветителем, вводят при помощи корнцанга стерильный тампон в область шейки матки и собирают ее содержимое. При частично закрытой шейке матки делают попытку раскрыть ее путем массирования влагалища через прямую кишку. Если из рога матки жидкость не поступает, то в ее полость через шейку матки вводят 100—200 мл стерильного изотопического раствора хлорида натрия через катетер или резиновую трубку с наконечником, соединенные на другом конце со 100-граммовым шприцем. Через 1—2 мин, не вынимая трубки, получают смыв в шприц, переливают его в стерильный сосуд и отправляют в лабораторию.
Молоко. Перед взятием проб молока вымя коровы обмывают теплой водой с мылом и вытирают чистым полотенцем. Затем соски протирают марлевым тампоном, смоченным 75%-ным спиртом или 1%-ным раствором борной кислоты. Первые 2—3 струи молока из каждой четверти вымени собирают в отдельную посуду и обезвреживают кипячением. После этого в стерильные широкие пробирки из каждой четверти вымени надаивают приблизительно 15—20 мл молока. Можно брать после доения последние порции молока и быстро выдаивать одну струю непосредственно в пробирки или чашки с плотной питательной средой (ППГГА), содержащей ингибиторы.
Отобранные порции молока из каждой четверти вымени центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин и вводят морским свинкам заражающую дозу из верхнего слоя (сливки) и осадка. Этот же материал высевают на плотную среду с краской. В пробирках, поступивших в лабораторию с посевом, сделанным на месте, заменяют пробки и обрабатывают пробирки спиртом. Посевы культивируют в обычных атмосферных условиях при содержании в эксикаторе 10—15% СO2. Молоко коров исследуют несколько раз с интервалом 5-10 дней.
Плацента, плодные оболочки. Для бактериологического исследования отбирают участок плаценты с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на ее поверхности фибрина или гнойного экссудата. Как и плод, части плаценты или плодных оболочек следует отсылать в лабораторию в замороженном виде, соблюдая при этом указанные выше меры предосторожности.
В лаборатории поверхность плаценты обрабатывают тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, просушивают сухими тампонами, прижигают шпателем, вырезают участки, предназначенные для исследования, размельчают в условиях стерильности, как это указано для органов плода, и засевают на плотную среду с ингибиторами. Кусочки плаценты (размером приблизительно 0,5 X 0,5 см) рекомендуется опускать перед размельчением на 1—2 с в кипящую воду. Из мест с хорошо выраженной отечностью посев может быть произведен непосредственно пастеровской пипеткой.
Аналогично проводят посевы из плодных оболочек. Более результативными, однако, бывают посевы, сделанные из амниотической жидкости на плотные среды.
Содержимое гигром, абсцессов и других полостей. Для получения содержимого патологической полости делают стерильно пункцию ее стенки иглой со шприцем. Пересылают пунктат в лабораторию в термосах со льдом. Посевы производят на плотные среды с ингибиторами.
Кровь. Посев крови делают в колбы вместимостью 200—250 мл, содержащие 100 мл жидкой питательной среды. На 100 мл среды добавляют 20 мл крови, взятой стерильно из яремной вены. Для посева крови используют среду Первушина, бульон альбими, трнптозный бульон, МПБ, содержащий 1% глюкозы и 2—3% глицерина.
Посевы крови от крупных животных лучше делать в колбы со средами непосредственно из вены. Для этой цели в ватную пробку колб, содержащих среду, монтируют тонкую резиновую трубку, конец которой соединяют с кровопускательной иглой. Всю систему, кроме иглы, стерилизуют завернутой в бумагу. Иглу стерилизуют отдельно. Взятие крови проводят стерильно. Посевы крови можно делать непосредственно в пробирки, подготовленные таким же образом.
Хорошие результаты получаются при высевах крови на комбинированные среды. В колбы вначале вводят плотную среду (ПГ1ГГА). После затвердения скошенного, агара в колбу вводят одну из указанных выше жидких сред в таком количестве, чтобы более половины плотной среды не покрывалось жидкой средой. Затем в колбу вводят свежевзятую стерильно кровь или делают посев крови непосредственно из яремной вены, как указано выше. Культивирование продолжается до 1 мес. Периодически раз в 3—4 дня контролируют рост бруцелл. При посевах на жидкие среды периодически производят отсев на косой плотный агар (ППГГА). При комбинированном методе отсевы не требуются.
По данным отечественной литературы, гемокультуры бруцелл успешно могут быть получены на куриных эмбрионах. Ряд иностранных авторов также рекомендует этот метод. Кровь, стерильно взятую в небольшом количестве (0,1—0,3 мл), вводят нескольким эмбрионам 4—7-дневного возраста в аллантоисный мешок (желток). Посев производят при просвечивании яиц. Место укола обрабатывают спиртом и смазывают спиртовым раствором йода, после извлечения иглы отверстие в скорлупе заливают парафином. Инкубация длится (при 37,5—38,5° С) 5—6 сут. Затем из желточного мешка делают посевы на плотную питательную среду. Н. Д. Анина-Радченко и Н. Ф. Браславец (1952) даже такой загрязненный материал, как мочу и гной, предварительно засевали в куриные эмбрионы и получили хороший результат. Они считают, что прямой посев на питательные среды в четыре раза менее эффективен по сравнению с методом предварительного инкубирования в курином яйце.
Моча. Для исследования мочу берут стерильно мочевым катетером в количестве 75—100 мл. Пробу мочи в количестве 50 мл центрифугируют при 2000—3000 об/мин в течение 10—20 мин. Жидкость над осадком удаляют, а из осадка готовят взвесь в 0,3—0,5 мл МПБ и засевают на плотную среду с ингибиторами.
Кал. К исследованию кала у животных прибегают редко. Пробы вежевзятого кала массой 1 г суспензируют в 50 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и фильтруют через несколько слоев марли для удаления грубых частиц. Затем фильтрат центрифугируют при 1000—2000 об/мин в течение 3—5 мин. Жидкость над осадком сливают в стерильную посуду, добавляют к ней гипериммунную бруцеллезную сыворотку в соотношении 1 : 100 и ставят и водяную баню (на 2 ч) или в термостат (на 3—4 ч) при температуре 37—38° С. Затем жидкость центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок взвешивают в стерильном изотоническом растворе и снова центрифугируют в течение 5 мин. Эту манипуляцию повторяют дважды, после чего осадок заседают на плотный агар с генцианвиолетом (1 : 200000) в бактериологические чашки или пробирки. Этим же материалом могут быть заражены морские свинки.