Повысить чувствительность различных вариантов гетерогенного иммунного анализа позволяет замена хромогенных субстратов на флюоресцентные.
Измерение флюоресценции и хемилюминесценции возможно в широких пределах в отличие от фотометрии, которая ограничена измерением оптической плотности в пределах двух единиц. Это обстоятельство дало толчок к развитию и широкому внедрению этих методов в исследовательскую практику.
Хемилюминесцентная метка отвечает основным требованиям, предъявляемым к маркеру, наиболее важными из которых являются стерильность, доступность, высокая чувствительность регистрации, низкий уровень фоновых реакций, простота измеряющей аппаратуры, возможность регуляции активности маркера.
Кроме того, важно отметить небольшой период выхода регистрируемого сигнала на стационарный уровень и длительность стационарного периода.
Материалы и оборудование. 1. Полистироловые измерительные кюветы (пробирки) (например, фирмы Clinicon). 2. Полистироловые матовые планшеты для ХЛИА (Dynatech Micro FLUOR Systems). 3. Люминометр 1250 LKB для измеренения хемилюминесценции в кюветах. Люминометр AM-141 Dynatech для проведения измерения в планшетах. 4. Пипетки автоматические на 100 и 200 мкл. 5. Шприц непрерывного действия. 6. Флаконы на 500, 200 и 100 мл. 7. Пипетки 1; 2; 5 мл. 8. Пробирки бактериологические. 9. Термостат. 10. Холодильник. 11. Иммунные сыворотки против тех возбудителей, которых собираются выявить (желательно моноклональные), в рабочем разведении. 12. Протеин А, меченный пероксидазой (в рабочем разведении). 13. Бычий сывороточный альбумин. 14. Перекись (пероксид) водорода (30%-я). 15. Люминол. 16. n-Иодфенол. 17. Твин-20. 18. Нитроцеллюлозные фильтры или пленка.
Приготовление ингредиентов. Раствор № 1. 0,1 М ФБР (pH 7,2…7,4) содержит: 1,425 г сульфата натрия двузамещенного водного, 0,2 г сульфата калия однозамещенного, 3 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия. Готовят растворением смеси солей в 500 мл дистиллированной воды с последующим доведением объема до 1000 мл; хранят не более 1 мес при 4 °С:
раствор № 1 а. К 100 мл раствора № 1 добавляют 0,05 мл Твина-20 и получают раствор для разведения исследуемого материала. Хранению не подлежит;
раствор № 1 б. В 100 мл раствора № 1 растворяют 0,5 г БСА, вносят 0,05 мл детергента и получают раствор для разведения конъюгата (КГ). Раствор не хранят.
Раствор №2. Трис-HCl буфер 0,1 М (pH 8,6) смешивают из расчета 25 мл 0,1 М трис (12,11 г трис-оксиметил-аминометана растворяют в 1000 мл дистиллированной воды и 6,2 мл 0,1 М НСl). Хранят не более 1 мес при 4 °С.
Раствор №3. 0,05 М КББ (pH 9,5…9,6) содержит: 0,59 г карбоната натрия и 1,73 г гидрокарбоната натрия. Готовят растворением смеси солей в 500 мл дистиллированной воды. Хранят не более 1 мес при 4 °С.
Раствор №4 (для отмывания). К 2000 мл дистиллированной воды добавляют 17,8 г NaCl. Перед употреблением вносят 0,05 % детергента. Хранению не подлежит.
Раствор №5. Иммуноглобулин (ИГ) разводят раствором № 3. Предназначен для сенсибилизации твердой фазы. Хранению не подлежит.
Раствор № 6. Конъюгат разводят до рабочего титра в растворе № 1 б. Хранению не подлежит.
Раствор №7. Субстратная смесь 1,25 мМ люминола, 2,7 мМ Н2O2 и 68 мМ параиодфенола в 0,1 М трис-HCl буфера (pH 8,6). Для этого необходимо приготовить три отдельных раствора:
раствор № 7 а. 5 мг люминола растворяют в 0,5 мл 0,05 М трис-HCl буферного раствора (pH 8,6). Хранят в холодильнике при 4 °С в темной посуде;
раствор № 7 б. 5 мг n-иодфенола растворяют в 5,5 мл 0,05 М трис-HCl буферного раствора (pH 8,6). Хранят в холодильнике в темной посуде;
раствор № 7 в. 0,1 мл пергидроля растворяют в 30 мл 0,05 М трис-HCl буфера (pH 8,6). Хранят 2 нед.
Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением. Для этого смешивают по 0,5 мл растворов 7 а, 7 б, 7 в. Общий объем доводят до 10 мл 0,05 М трис-HCl буферным раствором.
Подготовка материала к исследованию. Исследованию в ХЛИА подлежат культуры возбудителей инфекционных заболеваний, объекты с посевами, а также материал от больных животных и людей.
Посевы выращивают на оптимальных средах при 37 °С в течение 1…2 сут. Приготавливают смыв с агара плотной средней густоты 1 ∙ 107 м. т./мл и добавляют 1%-й формалин для обеззараживания.
Сыворотки от больных обезвреживают мертиолатом натрия 1 : 10 000 с последующим прогреванием при 56 °С в течение 30 мин. Кровь, пунктаты, внутренние органы, биопробы обеззараживают 1%-м формалином и выдерживают не менее 12 ч при комнатной температуре.
Проведение анализа. Выявление бактериальных антигенов. 1. В лунки планшетов или измерительных кювет вносят с помощью автоматической пипетки 100 мкл раствора № 5.
2. Сорбцию на планшетах и кюветах иммуноглобулина проводят в течение 18…24 ч при 4 °С.
3. Через 24 ч содержимое удаляют из лунок и отмывают твердую фазу трехкратно по 3 мин раствором № 4. Вытряхивают жидкость из планшетов, высушивают на воздухе в течение 3…5 мин.
4. В опытные кюветы и лунки помещают при помощи автоматической пипетки 100 мкл взвеси обезвреженных микроорганизмов или исследуемый материал.
5. Планшеты и кюветы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 2 ч при использовании планшетов и 18…24 ч при использовании кювет.
6. После экспозиции антиген из лунок удаляют и отмывают, как указано в п. 3.
7. В опытные и контрольные лунки вносят по 10 мкл раствора № 6 в рабочем разведении.
8. Планшеты и кюветы выдерживают в термостате при 37 °С в течение 1…2 ч.
9. Удаляют конъюгат из лунок и отмывают, как указано в п. 3.1.3, но кратность отмывания увеличивают до 5 раз.
10. В каждый резервуар планшета или кюветы вносят субстратную смесь (в опытные и две контрольные).
11. В опытных рядах, где прошла реакция, возникает эмиссия, которая регистрируется люминометром в микровольтах (mV) (отклонение стрелки на шкале прибора).
12. Контроли:
а) контроль конъюгата (К1) — постановка в описанной последовательности, но вместо антигена вносят раствор № 1. Контроль отрицательный;
б) контроль субстратной смеси (К2) — постановка в описанной последовательности, но вместо конъюгата вносят раствор № 1 б. Контроль отрицательный.
Обнаружение специфических антител. 1. В лунки планшетов или кюветы вносят по 100 мкл раствора соответствующего антигена или микробную взвесь в концентрации 1 ∙ 109 м. т./мл.
2. Сорбцию на твердую фазу осуществляют в течение 18…24 ч при 4 °С.
3. После указанной экспозиции антиген удаляют из лунок и отмывают носитель трехкратно по 3 мин раствором № 4. Затем удаляют буферный раствор и высушивают на воздухе 3…5 мин.
4. В опытные лунки вносят по 100 мкл исследуемого патматериала (кровь, сыворотка или смыв из грудной полости).
5. Планшеты или кюветы выдерживают при 37 °С в течение 2…4 ч.
6. После этого материал удаляют и отмывают, как указано в и. 3.
7. В опытные лунки и одну контрольную закапывают по 100 мкл рабочего раствора конъюгат-протеин А-пероксидазы (раствор № 6).
8. Пробирки или планшеты выдерживают при 37 °С в течение 2 ч.
9. Конъюгат удаляют и отмывают раствором № 4 пятикратно по 3 мин.
10. В каждую лунку, в том числе в контрольные, вносят субстратную смесь.
11. Контроли:
а) контроль конъюгата (К1) — ХЛИА ставится описанным способом, но вместо патматериала исследуют раствор № 1 а. Контроль отрицательный;
б) контроль субстратной смеси (К2) — реакцию ставят в описанной последовательности, но вместо конъюгата в лунку вносят раствор № 1 б. Контроль отрицательный.
12. Учет результатов. Реакция учитывается при помощи люминометра. Регистрируют величину интенсивности свечения в лунках планшета или кювете в условных единицах (mV). Разница в показаниях между опытными и контрольными лунками должна быть не менее чем в 4 раза.
В резервуарах, в которые внесли соответствующие антигены, показатели прибора составляют десятки микровольт. В резервуарах, в которые вместо антигена внесли раствор № 1 а, показатели прибора остаются низкими (К1).
В лунках, в которые внесли раствор № 1 б, реакция не происходит (К2).
Система реакции считается специфически положительной при наличии выраженной разницы между опытными и контрольными показателями не менее чем в 4 раза.
Хемилюминесцентная детекция ДОТ-анализа
Нитроцеллюлозные фильтры (d=5 см) с обработанными пробами после заключительного отмывания помещают на дно полистироловых кювет и вносят субстратную смесь. Пробы помещают в кюветах отделения люминометра и учитывают результаты, как указано выше.
Практическое использование. При использовании ХЛИА и ТИФА для лабораторной диагностики зооантропонозов оказалось, что ХЛИА несколько чувствительнее ТИФА (на один порядок). Для сравнения чувствительности и специфичности ХЛИА с общепринятыми серореакциями (А. Т. Яковлева и др., 1990) использовали представительную коллекцию микроорганизмов, включающую свыше 150 штаммов.
Все проверенные в ХЛИА штаммы В. mallei, В. pseudomallei дали положительный результат в отличие от 25 близкородственных псевдомонад. При исследовании коллекции сибиреязвенных бацилл в ХЛИА наблюдали единичные ложноположительные результаты с В. subtilis, В. mycoides. По-видимому, при использовании более специфичных ПИК эти недостатки будут устранены.
Из 17 исследованных штаммов бруцелл и близкородственных микроорганизмов только с Y. enterocolitica 09 была зарегистрирована положительная реакция, что подтверждает давно установленный факт наличия антигенных связей между бруцеллами и иерсиниями.
ХЛИА был успешно применен в иммунодиагностике для исследования различного экспериментального и полевого патологического материала на присутствие специфических антигенов.
По эффективности обнаружения специфических антигенов ХЛИА несколько превышает РИГА и даже ТИФА.
ХЛИА оказался непригоден для исследования объектов окружающей среды (почвы, воды, смывов и др.) из-за фоновых помех, поэтому для индикации его использовать не следует.
При исследовании 503 образцов крови диких грызунов на наличие противочумных антител положительные результаты в ХЛИА получены в 11 случаях, в ТИФА — в 9. В этих тестах исследованы мелиоидозные антитела из сывороток 54 зараженных золотистых хомячков. Выявлено 50 и 48 серопозитивов. При анализе на антиген материала от 41 больного бруцеллезом находки составили в ХЛИА 35 и в ТИФА 31, от 96 работников мясокомбината — 61 и 53 соответственно.
Таким образом, ХЛИА можно использовать для иммунодиагностики бактериальных особо опасных инфекций.