Осборн и сотр. первыми предприняли широкое аналитическое исследование клейковины и ее фракций. Для элементарного состава глиадина и глютенина они получили следующие величины.
Хорошее совпадение значений для этих более или менее очищенных веществ является указанием, что эти величины можно считать справедливыми и для клейковины, из которой получены эти вещества. Присутствие небольших количеств водорастворимых белков, обычно содержащихся в клейковине, полученной путем отмывания, вероятно, оказывает большее влияние на содержание отдельных аминокислот, чем на элементарный состав. Величина общего азота, равная примерно 17,5%, является главным основанием для использования коэффициента 5,7 для перевода полученных по Кьельдалю величин азота в показатели для общего белка пшеничных продуктов. Хотя содержание общего азота в альбуминном и глобулиновом белках равно соответственно 17,1 и 18,6%, эти величины вызывают только незначительное отклонение от коэффициента пересчета, поскольку содержание каждого из этих белков в муке, как правило, не превышает 10% общего азота.
Таким образом, ошибка, которую вносят глобулиновые компоненты, сравнительно мала и непостоянна. В литературе имеется мало данных относительно содержания азота в белках отрубей и зародыша, представленных, по-видимому, почти полностью альбуминами и глобулинами.
Данные по содержанию аминокислот в клейковине, обобщенные Блишем, были получены до расцвета хромато графических и микробиологических методов определения и имели много недостатков в связи с трудностями анализа. Современные данные для клейковины и отдельных ее компонентов представлены. Тем не менее в данном разделе будут рассмотрены основные особенности аминокислотного состава клейковины и ее компонентов, поскольку они определяют химические свойства и поведение клейковины. Характерной особенностью аминокислотного состава клейковины является необычайно высокое содержание глютаминовой кислоты, пролина и амидного азота. Примечательным является также сравнительно низкое содержание основных аминокислот и триптофана. Характерные особенности растворимости клейковины и ее фракций могут объясняться низким содержанием в них ионизируемых групп. Основные группы малочисленны, многочисленные же карбоксильные группы в значительной степени связаны в амидной форме. Большое число боковых цепей, несущих амидные группы, также затрудняет образование многочисленных водородных связей между белковыми цепями. Связывание полярных липидов, таких как фосфатидная кислота и лизолецитин, которые, логически рассуждая, должны находиться на заряженных участках молекулы, может также оказывать влияние на растворимость и на способность молекул к взаимодействию и вследствие этого на дальнейшее уменьшение числа ионных (заряженных) групп.
Подсчет ионизируемых групп клейковины, основанный на данных аминокислотного состава, показал присутствие 27—30 карбоксильных групп, большей частью в амидной форме, двух гидроксильных групп тирозина и 4—6 основных групп в 10 000 г белка, причем эти количества до некоторой степени зависели от того, имели ли дело с неочищенным клейковинным студнем или с очищенной клейковиной. Определение, основанное на кривых титрования пшеничной клейковины, дало следующие количества ионизирующихся групп на 100 000 г белка: карбоксильных — 29, имидазольных—15, альфа-амино — 2, сульфгидрильных — одна, тирозильных — 20, лизильных — 9. Константы ионизации, присущие каждой отдельной группе, являются, по-видимому, нормальными для всех групп, за исключением имидазольной, где она несколько низка. Поскольку установлено, что общее количество остатков глютаминовой и аспарагиновой кислот составляет примерно 312 для одного и того же веса белка, особенный интерес представляло точное определение свободных карбоксильных групп.
Глиадиновые компоненты обычно содержат больше карбоксильных групп, также в основном в амидной форме, но меньше основных групп, чем клейковина, что согласуется с особенностями их растворимости (за исключением омега-глиадина) и их электрофоретической подвижностью при низких рН. При щелочных значениях рН, когда ионизация основных групп подавлена, глиадиновый компонент неспособен растворяться и обладает очень низкой электрофоретической подвижностью, вследствие того, что практически все карбоксильные группы находятся в неионной амидной форме.
Ряд исследователей показали, что все имеющиеся в белке пшеницы сульфгидрильные группы почти поровну разделены между растворимыми белками и белками клейковины. Распределение сульфгидрильных групп между различными белками клейковины еще не изучено, хотя было установлено, что сульфгидрильные группы, имеющие наиболее непосредственное отношение к изменению свойств теста во время замешивания, локализованы, по-видимому, в глютениновой части комплекса. Общее количество сульфгидрильных групп в муке невелико. На каждые 10—12 молей цистина приходится всего 1 эквивалент сульфгидрильных групп. Такие небольшие количества сульфгидрильных групп лучше всего определять методом амперометрического титрования, используя доведенные почти до нейтрального рН растворы хлористой ртути и азотнокислого серебра. Степень чувствительности сульфгидрильных групп к окислению такими улучшителями хлеба, как бромат или йодат, не вполне определена, хотя несомненно, что, по крайней мере, часть их реагирует с этими веществами. Издавна считалось, что увеличение сопротивления замесу во время формирования теста объясняется окислением сульфгидрильных групп с образованием дисульфидных мостиков. Однако с теоретической точки зрения более вероятным кажется обмен радикалов между сульфгидрильными группами и дисульфидными мостиками.
Дисульфидные мостики в клейковине особенно важны, по-видимому, для поддержания структурной целостности белков, поскольку их разрыв при восстановлении даже небольшого числа дисульфидных групп вызывает быстрый и сильный распад некоторых белковых цепей. Как показали сравнительно недавние исследования, при восстановлении глютенина образуется большое количество фрагментов, тогда как из глиадина они совсем не образуются. При замешивании с небольшим количеством какого-либо восстанавливающего агента или с сильной щелочью клейковина сама быстро теряет свои пластические и упругие свойства и вязкость. Как это имеет место и в случае других белков, ионизирующая радиация вызывает значительный разрыв молекулярных связей в клейковине, причем особенно разрушаются дисульфидные мостики. Весьма вероятно, что чувствительность клейковины к щелочи объясняется чувствительностью к ней дисульфидных мостиков. В сильно щелочных растворах глиадина осмотическое давление постепенно увеличивается, а константа седиментации падает, что свидетельствует о распаде его молекул. По данным Короса, при молекулярном весе, равном 27 500, глиадин содержит три М-концевых остатка, однако это представление подвергнуто сомнению Дейчем, который не смог найти ни одного А-концевого остатка гистидина. В глиадине из твердой пшеницы последний автор нашел один JV-концевой остаток тирозина, а в глиадине из обыкновенной пшеницы он нашел по одному iV-концевому остатку глютаминовой кислоты и тирозина. Повторное исследование этого вопроса Рамачандраном и Мак-Коннелом вновь подтвердило данные о том, что глиадин при молекулярном весе 27 000 содержит три концевых остатка гистидина. Кроме того, получены доказательства, что глютаминовая кислота и лейцин занимают С-концевое положение. В изученных препаратах установлено также присутствие ничтожных количеств Af-концевых аспарагиновой и глютаминовой кислот, аланина, валина и серина. В другой работе приводятся данные о наличии в клейковине ЛА-концевого серина. В более поздней работе Финлейсона и Мак-Коннела с окисленным глиадином показано, что глютаминовая кислота, треонин и фенилаланин занимают iV-концевое положение. Войчик и сотр. показали, что глютаминовая и аспарагиновая кислоты и треонин являются iV-концевыми группами глютенина; глиадин, кроме того, содержит iV-концевые серии и аланин. Винцор и Центнер добавили к списку установленных Af-концевых аминокислот клейковины глицин, лейцин и метионин. Для выяснения этой довольно запутанной картины необходима более обширная работа с очищенными фракциями. По-видимому, необходимо также соблюдать меры предосторожности против образования артефактов, которые могут иметь место в результате обмена радикалов между сульфгидрильными и дисульфидными группами. Метилирование глютенина с помощью диметилсульфата приводит к образованию фибриллярного белка, который набухает в воде, поглощая ее в 375-кратном количестве по отношению к своему весу и образуя плотный гель. Типичный препарат содержал 3% метоксильных и 1,2% метиламидных групп; при этом метилированию подвергаются, по-видимому, только аминные и карбоксильные группы. Безводный хлористый водород в метиловом спирте также вызывает метоксилирование карбоксильных групп путем замещения амидных групп. Подобная гельобразующая способность сульфатных и фосфатных производных клейковины была описана ранее. Фосфорилированный продукт лучше всего образуется при нагревании сухой клейковины со смесью фосфорной кислоты и концентрированного раствора мочевины. Ортофосфатные группы, по-видимому, этерифицируются с гидроксильными группами серина и треонина. Денатурированная клейковина не образует производных, способных к образованию геля. Реакция глиадина с ангидридами с последующим взаимодействием с пропаноламином использовалась для получения водорастворимых полипептидильных производных, поли-аланил-глиадина — и поли-аспартил-глиадина соответственно.
К другим недавно изученным производным клейковины относится соединение клейковины с краской тиазоловым желтым, с помощью которой микроскопически были изучены стадии превращения клейковины при замешивании теста и других технологических процессах. Обработка 2,4- фтординитробензолом приводит к образованию двух фракций, одна из которых растворима в воде. Ультрацентрифугирование растворимой части не показало ее гомогенности, однако, исходя из результатов других опытов по ультрацентрифугированию, можно предположить, что это растворимое производное образуется из глиадина.
Исследование реакционной способности групп боковых цепей (боковых групп) сырой и сухой клейковины в процессе ее прогревания выявило ранее предполагавшееся увеличение их реакционной способности по мере повышения температуры. Исключение в этом смысле представляют основные группы, у которых наблюдался период замедления в реакции с кислыми красками. Изменение поглотительной способности теста с увеличением температуры имеет волнообразный характер, возможно, из-за наличия индукционного периода у основных групп. В другой работе тепловая денатурация клейковины прослеживалась по изменению ее растворимости в разбавленной кислоте и по изменению хлебопекарных качеств «воссозданного» теста. Энергия активации всей реакции, являющейся, по-видимому, реакцией первого порядка, определенная методом пробной выпечки, была равна 35 000 кал/моль, а методом растворимости — 44 000 кал/моль. Скорость денатурации была максимальной при влажности от 35 до 40%. При рН 4 денатурация была медленной, но усиливалась при более высоких значениях рН. При низких значениях рН имело место ухудшение хлебопекарных качеств, не связанное с нагреванием. Денатурация глиадиновой фракции была менее быстрой по сравнению с денатурацией всей клейковины, и ее можно было заметить благодаря наличию определенного индукционного периода.
Чрезвычайно интересное и важное исследование поглощения меченой радиоактивной аминокислоты составными частями семени позволяет предположить, что максимальная скорость биосинтеза глиадина достигается в более поздний период, чем дляглютенина, альбуминов и глобулинов; возможно, что глиадины самостоятельно участвуют в образовании белков, хотя на основании более поздних сведений о составе глиадина можно допустить, что за эти факты ответственны отдельные компоненты данной группы белков. Так, например, появление активности в отдельных, различимых глиадиновых компонентах происходит неравномерно и, вероятно, с различными скоростями во время созревания зерна. Белки оболочек образуются, по-видимому, на более поздних стадиях созревания зерна, чем белки эндосперма.