Одно из наиболее замечательных достижений современной биохимии — это установление строения дезоксирибонуклеиновой кислоты с точки зрения как состава ее молекулы, так и ее пространственной конфигурации.
Если удастся установить, что ДНК представляет собой вещество, ответственное за передачу наследственных особенностей на молекулярном уровне, то станет возможным установить совершенно определенную зависимость между цитологической картиной поведения хромосом и строением и метаболизмом ДНК. Интересно, что в результате ряда весьма остроумных экспериментов и теоретических построений такая зависимость действительно начала вырисовываться. В этой области еще много несоответствий и довольно смелых экстраполяций, однако современное состояние вопроса дает основания для оптимистических ожиданий.
В 1948 г. представление о ДНК, как о цепи, состоящей из периодически повторяющихся тетрануклеотидных единиц, получило серьезный удар со стороны Вишера и Чаргаффа, а также Хочкиса, которые показали при помощи хроматографии, что четыре гетероциклических основания присутствуют в ДНК в неравных количествах и что некоторые образцы ДНК содержат не четыре основания, а больше. Со времени этих исследований перечень пуриновых и пиримидиновых оснований, входящих в нативные молекулы ДНК, возрос до семи и представления о деталях строения ДНК подверглись существенным изменениям.
На основании изучения продуктов, получаемых из ДНК при кислотном или ферментативном гидролизе, можно наметить следующие последовательные стадии ее распада.
При гидролизе рибонуклеиновой кислоты (РНК), примерно 0,9 которой находится в цитоплазме клеток, а 0,1 — в ядре, образуются те же продукты, только вместо дезоксирибозы выделяется рибоза, а вместо тимина — урацил. Связи, соединяющие нуклеотиды в молекуле РНК, в основном сходны с таковыми в молекуле ДНК, однако о конфигурации молекулы РНК известно гораздо меньше.
ДНК → Нуклеотиды → Нуклеозиды + Фосфорная кислота → Пуриновые и пиримидиновые основания + Дезоксирибоза
В большинстве образцов ДНК преобладает четыре гетероциклических основания: пурины — аденин и гуанин — и пиримидины — тимин и цитозин. Однако некоторые образцы ДНК (например, ДНК из зародышей пшеницы и из других злаков) содержат в больших количествах 5-метилцитозин; незначительные количества этого производного цитозина обнаружены также в препаратах из тканей млекопитающих. ДНК, полученная из «четных» фагов группы Т (Т2, Т4 и Т6), содержит 5-оксиметилцитозин вместо цитозина. Необычный пурин (6-метиламинопурин) обнаружен в ДНК некоторых бактерий. Однако при обсуждении общих вопросов мы будем иметь в виду лишь четыре обычных основания.
Сахар дезоксирибоза вместе с остатками фосфорной кислоты образует химический остов молекулы ДНК. Поскольку дезоксирибоза имеет только три гидроксильные группы и поскольку одна из них (в положении 1) участвует в образовании N-рибозидной связи с одним из четырех гетероциклических оснований, чередующиеся фосфорные остатки должны быть связаны двойной эфирной связью с гидроксильными группами в положениях 3 и 5. На основе этих сведений мы можем нарисовать общую картину строения ДНК. Для того чтобы закончить чисто химическое описание ДНК, мы должны лишь добавить к каждому углероду в положении 1 соответствующие пуриновые или пиримидиновые основания.
Это очень трудная задача. Состав ДНК сильно варьирует в зависимости от ее происхождения; кроме того, в настоящее время имеется достаточно данных в пользу того, что большинство образцов ДНК, по всей вероятности, гетерогенны и, по-видимому, представляют собой смесь молекул, различающихся по содержанию оснований и их чередованию. Несмотря на эти трудности, анализ многих образцов ДНК, полученных из различных биологических источников, привел к установлению следующих количественных соотношений, которые обычно наблюдаются в природе с большими или меньшими уклонениями.
1. Стехиометрическое равенство между суммой пуринов и суммой пиримидинов.
2. Содержание аденина и тимина соответствует содержанию гуанина и цитозина (или суммы цитозина и его менее распространенных производных, если таковые присутствуют). Существует два типа ДНК: один, в котором сумма аденина и тимина больше, чем сумма гуанина и цитозина (тип АТ), и противоположный (тип ГЦ), обнаруживаемый главным образом у микроорганизмов.
3. Содержание 6-аминогрупп равно содержанию 6-кетогрупп.
Кроме того, имеется ряд условий, которым должны удовлетворять данные о последовательности оснований; этих данных пока еще мало, но они быстро накапливаются.
Указанные закономерности сами по себе говорят о том, что молекулы ДНК, вероятно, построены по определенному плану и что расположение гетероциклических оснований имеет, по-видимому, большое значение в функциональных особенностях ДНК.
Другие имеющиеся в настоящее время данные также свидетельствуют о том, что последовательность оснований никоим образом не может быть случайной. Например, Синсхеймер выделил из частичных гидролизатов ДНК много различных динуклеотидных фрагментов. Отдельные приведенные сочетания встречаются гораздо чаще, чем другие. Недавно Шапиро и Чаргафф провели сходные опыты по фракционированию; на основании полученных результатов они сделали заключение, что по крайней мере 70% пиримидинов в различных образцах ДНК встречаются в составе «олигонуклеотидных отрезков», где они содержатся подряд в трех или более мононуклеотидах. Согласно трем приведенным выше правилам, такой тип скоплений должен наблюдаться также для пуринов.
В настоящий момент никаких других данных по основному интересующему нас вопросу — последовательности оснований — нет. Однако достигнуты решающие успехи в изучении пространственной конфигурации молекулы ДНК. Большая часть имеющихся в этой области данных основана на результатах изящных исследований полученной из разных источников ДНК методом рентгеноструктурного анализа. Картины дифракции во всех случаях были удивительно сходными, свидетельствуя о том, что молекулярная структура всех этих ДНК однородна. Полученные данные показали, что молекула ДНК содержит две или более полинуклеотидных цепей, образующих спиральную структуру, и позволили приблизительно определить размеры спирали.
Используя данные Уилкинса и его сотрудников и учитывая разнообразные стерические ограничения, Уотсон и Крик сконструировали модель, соответствующую большей части экспериментальных данных. Эта модель, несмотря на некоторые недостатки, которые были впоследствии устранены Уилкинсом и его сотрудниками, оказалась необычайно плодотворным стимулом для работ в области химии нуклеиновых кислот и генетики. В основу модели Уотсона и Крика, помимо аналитических данных о содержании оснований в молекуле ДНК и результатов рентгеноструктурного анализа, легли также факты, обнаруженные в исследованиях с применением титрования и показывающие, что полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК соединены друг с другом водородными связями через остатки оснований.
Допущения, принятые Уотсоном и Криком, сводятся к следующему: 1) число цепей в молекуле равно двум; 2) благодаря специфичному способу попарного соединения оснований любая пара оснований симметрична и равноценна любой другой в качестве поперечного мостика, соединяющего две нити углеводофосфатного остова.
Постулированные для этой модели пары оснований аденин — тимин и гуанин — цитозин, связанные между собой водородными связями, взятой из работы Полинга и Кори, которые детально разобрали модель ДНК в виде чвойной спирали с точки зрения кристаллических особенностей пуринов и пиримидинов. Результаты их исследований показали, что между цитозином и гуанином возможно образование трех водородных связей и что поэтому в модели ДНК следует придавать еще большее значение специфичности попарного соединения оснований, чем это делали Уотсон и Крик, полагавшие, что между попарно соединенными основаниями образуется всего две водородные связи.
У модели имеется интересная особенность: две нити полинуклеотидов комплементарны, т. е. дополняют одна другую, и расположение нуклеотидов в одной нити определяет расположение их в другой. Так, если в одной нити последовательность оснований имеет вид А—Г—Г—Т—Ц—А, то в комплементарной нити они расположатся в порядке Т—Ц—Ц—А—Г—Т. Этот факт имеет определенное значение для объяснения процесса генетического удвоения, к рассмотрению которого мы вскоре перейдем.
Модель Уотсона — Крика получила значительную поддержку; она, безусловно, представляет собой прекрасную рабочую гипотезу. Однако мы должны помнить, что это только модель, и поэтому считаем необходимым рассмотреть все доводы за и против нее.
Данные, подтверждающие наличие двойной спирали, были получены в работах Томаса, а также Шумейкера, Ричардса и Шахмана. В обеих работах на основании исследований изменений рассеяния света и вязкости в процессе частичного ферментативного переваривания ДНК, был сделан вывод, что в основном молекула ДНК состоит из двух цепей, связанных друг с другом. Авторы рассчитали, что если бы молекула ДНК состояла из одной цепи, то средний молекулярный вес получаемых фрагментов ДНК был бы значительно меньше наблюдаемого в опыте и что наблюдаемые факты хорошо согласуются с предположением о системе достаточно прочных поперечных связей между двумя полинуклеотидными цепями.
Ряд наиболее убедительных данных в пользу структуры, состоящей из двух взаимодополняющих цепей, получен Месельсоном и Сталем, применившими методику центрифугирования, разработанную Виноградом и его группой в Калифорнийском технологическом институте. Виноград использовал способность концентрированных растворов солей (например, хлористого цезия) образовывать градиент плотности под влиянием центрифугирования при больших скоростях.
Такое макромолекулярное вещество, как ДНК, растворенное в растворе соли, находит внутри градиента соответствующую ему плотность и образует в камере центрифуги относительно четкую линию; эту линию легко обнаружить по сильному поглощению ультрафиолетовых лучей. Если имеются два типа ДНК, различающиеся по плотности, то они разделяются и образуют две различимые зоны. Таким путем, например, в смеси двух ДНК — нормальной и содержащей более тяжелый пиримидин (бромурацил) — удается определить относительное количество той и другой ДНК.
Месельсон и Сталь выращивали кишечную палочку на питательной среде, содержавшей в качестве источника азота лишь тяжелый изотоп N15, и получили популяцию, сплошь меченную этим изотопом. Затем они переносили клетки, взятые в период логарифмического роста, на среду, компоненты которой содержали N14. Первую пробу для исследования брали после того, как популяция удвоилась, а вторую — после того, как она удвоилась вторично. Из обеих этих проб, а также из исходных клеток, полностью меченных N15, приготовляли препараты ДНК. Затем каждый из полученных препаратов растворяли в концентрированном растворе хлористого цезия, плотность которого приближалась к плотности ДНК, и центрифугировали до тех пор, пока в центрифугируемой жидкости не устанавливалось состояние равновесия. ДНК, полученная из препаратов бактерий, меченных N15, дает одну полосу, соответствующую плотности, характерной для N15-ДНК. В препарате ДНК из пробы, взятой после первого деления, эта полоса исчезла и ее заменила полоса с плотностью, характерной для смеси равных количеств N14-ДНК и N15-ДНК. Наконец, препараты из проб, взятых после двух делений, дают две полосы: одна из них соответствует 100% N14-ДНК, а другая — смеси N14— и N15-ДНК в отношении 50:50.
В тех опытах, где клеткам была предоставлена возможность размножаться с образованием дальнейших поколений, полоса, соответствующая смеси, все более и более сужалась и замещалась полосой, соответствующей N14-ДНК. Если бы в процессе удвоения ДНК имелась промежуточная стадия распада ДНК на более мелкие фрагменты с последующим использованием этих фрагментов для синтеза новых молекул ДНК, то плотность молекул ДНК из бактерий первого поколения не могла бы так точно соответствовать специфичной эквимолярной смеси «легких» и «тяжелых» цепей. В таких условиях скорее следовало бы ожидать широкого диапазона плотностей, чего на самом деле обнаружено не было.
Полученные результаты хорошо согласуются с гипотезой Уотсона и Крика. Каждую нить двойной спирали ДНК можно рассматривать как матрицу, по образцу которой в процессе удвоения строится новая нить. В случае немеченных нуклеотидов-предшественников следует ожидать, что две дочерние спиральные нити, образовавшиеся при одном удвоении, окажутся меченными наполовину. После второго удвоения получится по две меченых и по две немеченых нити. Попарное соединение оснований обеспечивает точность в построении комплементарных нитей, поддерживая, таким образом, генетическое постоянство.
Схема попарного соединения оснований, предложенная Уотсоном и Криком, получила сильную поддержку со стороны Корнберга и его сотрудников, проводивших энзимологическое изучение синтеза in vitro молекул, сходных с ДНК. Из экстрактов микробов они выделили чистый фермент, который в присутствии «затравки» в виде ДНК катализировал конденсацию дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с образованием длинных полидезоксинуклеотидных цепей и с освобождением пирофосфата. В дальнейших исследованиях степень чистоты фермента была повышена в 4000 раз по сравнению с исходным экстрактом, и был выявлен ряд важных особенностей этой системы. Наиболее важное открытие состояло в том, что в состав вновь синтезированного полимера (имеющего молекулярный вес порядка 5 · 106) входят те же пуриновые и пиримидиновые основания и в тех же соотношениях, которые характерны для «затравки», несмотря на то, что все трифосфаты добавлялись в одинаковых количествах. Например, при добавлении ДНК из Aerobader aerogenes, для которой характерно отношение (Аденин + Тимин) : (Гуанин + Цитозин) = 0,82, индуцировалось образование «ДНК», в которой это отношение было равно 0,99. При введении ДНК фага Т2, в которой это отношение равно 1,91, у вновь синтезированного полимера оно было равно 1,98. В соответствии с допущением Уотсона и Крика относительно образования пар оснований, дезоксиуридинтрифосфат включался в ДНК только вместо тимидинтрифосфата, а дезоксиинозинтрифосфат — только вместо дезоксигуанозин трифосфата. Эти данные представляют собой важный шаг вперед: они не только помогают выяснить структуру ДНК, но и могут послужить в будущем ключом для синтеза полйдезоксинуклеотидов со специфической биологической активностью.
Все описанные выше эксперименты имели дело с генетическим материалом на молекулярном уровне. Результаты этих экспериментов приобретут значение для биологии лишь в том случае, если их удастся использовать для объяснения поведения ДНК на уровне организованной хромосомы или же если они хотя бы будут совместимы с этим поведением. Экстраполяция в данном случае очень смелая, и поэтому многое приходится принимать на веру. Мы можем, например, определить, что одна гаплоидная клетка лилии содержит примерно 53 · 10-12 r ДНК. Допустив, что эта ДНК имеет вид длинной двойной спирали можно вычислить, что длина этой спирали будет равна 1,5 · 107 μ или 15 м, и число витков в ней равно 4,4 · 109. Механические проблемы, связанные с раскручиванием такой спирали во время процесса удвоения, настолько велики, что эта простая картина теряет всякий смысл.
Несмотря на огромный разрыв между знаниями о строении ДНК и о структуре хромосомы, недавно проведенные опыты по изучению удвоения хромосом ясно показывают, что необходимо создать какую-то гипотезу, которая объединяла бы химические и цитологические данные. Тэйлор и другие выполнили на клеточном уровне опыт, эквивалентный эксперименту Месельсона и Сталя. Применяя методику, сходную с методикой, использованной Говард и Пелком, они изучили распределение метки между дочерними клетками в последовательных поколениях. Однако их методика оказалась гораздо точнее, поскольку в качестве меченого предшественника ДНК они применяли не радиоактивный фосфат, а тимидин, меченный тритием. Поскольку тритий испускает р-частицы, обладающие значительно меньшей энергией, чем частицы, испускаемые фосфором, места почернения на пленке гораздо более четко ограничены и получающиеся радиоавтографы довольно точно соответствуют клеточным структурам, наблюдаемым под микроскопом.
Проростки Vicia faba выращивали на среде, содержащей тимидин, меченный тритием. В течение инкубации большая часть (из 12) хромосом приобрела метку, о чем свидетельствует соответствие между расположением зерен серебра на фотографической эмульсии и картиной хромосом, наблюдаемой под микроскопом. На этой стадии корешки переносили в содержащий колхицин раствор нерадиоактивного тимидина и инкубировали в течение различных промежутков времени. В присутствии колхицина хромосомы сокращаются до метафазного состояния, сестринские хроматиды (две отдельные нити двойной хромосомы) отходят друг от друга, и их легко наблюдать. Поскольку колхицин тормозит характерное для анафазы расхождение хромосом и последующее образование дочерних клеток, но не подавляет удвоения хромосом, подсчет пар хромосом в каждой клетке позволяет установить, сколько раз происходило удвоение хромосом. Таким образом, в клетках, содержащих 24 и 48 хромосом, удвоение произошло соответственно один и два раза.
Тэйлор и его сотрудники обнаружили, что в клетках с 24 хромосомами в каждой паре метафазных хромосом меченой оказалась лишь одна из хроматид. Следовательно, после удаления проростков из исходного раствора запас меченого предшественника в клетках быстро истощился и при удвоении хромосом (в результате которого их стало 24), использовался нерадиоактивный тимидин.
В клетках, содержащих по 48 хромосом, произвести анализ всех хромосом было невозможно. Однако часть из них лежала достаточно далеко от других, и их можно было хорошо рассмотреть; примерно у 50% этих хромосом одна из сестринских хроматид оказалась меченой, а другая — нет, у остальных же 50% немеченными оставались обе хроматиды. Иногда в паре хромосом «второго поколения» отдельные сестринские хроматиды оказались меченными лишь частично, и в этих случаях соответствующий участок другой хроматиды также был радиоактивным. Подобной картины следовало бы ожидать в случае перекреста, и она напоминает цитологические наблюдения, сделанные на хромосомах других видов (например, на гигантских хромосомах дрозофилы).
Полученные результаты схематично представлены. Эта схема предполагает, что каждая хромосома состоит из двух половинок, которые соединены центромерой и образованы из двух одинаковых нитей. В начальный период включения метки каждая хроматида становится радиоактивной, и фигуры метафаз в клетках, содержащих по 12 хромосом, можно четко связать с почернением эмульсии. После второго удвоения каждая пара хромосом все еще радиоактивна, однако вся метка находится в исходной материнской нити, а вновь образовавшаяся нить радиоактивностью не обладает.
Ла-Кур и Пеле недавно повторили эти опыты в отсутствие колхицина. В их опытах радиоактивность была распределена между обеими хроматидами. В период удвоения свободных меченых предшественников не было. Эти результаты, полностью противоположные данным Тэйлооа, Вудса и Хьюза,
Поскольку мало вероятно, что двойная спираль ДНК тянется вдоль всей хромосомы, Тэйлор, Вудс и Хьюз предложили интересную модель, которая соответствует как данным, полученным в их опытах с радиоактивными изотопами, так и теоретическим допущениям о наличии двойной спирали. Согласно этой модели, хромосома имеет сердцевину, состоящую из двух половинок, причем к каждой из этих половинок прикрепляется по одной нити от каждой из множества двойных спиралей.
Когда клетка вступает в митоз, эти половинки расходятся, причем каждая из них уводит с собой одну из двух комплементарных полинуклеотидных цепей. Тэйлор и его сотрудники отмечают, что эта модель вводит в объяснение явления перекреста еще одно новое измерение, а именно: обычный перекрест может происходить путем обмена вдоль сердцевины, тогда как более мелкие рекомбинации и генные конверсии могут происходить путем взаимодействия или обмена между боковыми цепями ДНК.
Подводя итоги, можно сказать, что в пользу предположения о существовании в молекуле ДНК комплекса перевитых спиральных цепей полинуклеотидов свидетельствуют многие данные. Модель, предложенная Уотсоном и Криком, в настоящее вновь ставят вопрос о том, осуществляется ли удвоение при помощи вполне «консервативного» механизма, при котором хромосомная нить, однажды образовавшись, сохраняется в ядре в виде более или менее неизменной химической структуры.
время представляется наиболее удовлетворительной. Хотя Донохью показал, что для построения моделей в виде двойной спирали, можно подобрать некоторые другие сочетания пар оснований, однако они не соответствуют дифракционной рентгенограмме ДНК, и в настоящий момент наиболее вероятными представляются пары аденин — тимин и гуанин — цитозин. Комплементарность двух нитей ДНК послужила основой для построения интересной гипотезы об удвоении генетического материала, которой соответствуют экспериментальные данные как на молекулярном, так и на клеточном уровне.
Перейдем к краткому обзору данных, которые не укладываются в рамки гипотезы Уотсона и Крика. Их не так много, как тех, которые свидетельствуют в пользу этой гипотезы, возможно потому, что ученых, так же как и прочих граждан, привлекает сенсация.
Было высказано мнение, что гипотезу об удвоении ДНК, основанную лишь на комплементарной структуре полинуклеотидных цепей, трудно примирить с некоторыми аналитическими данными о количестве отдельных нуклеотидов. Синсхеймер выделил ряд динуклеотидов из ДНК зобной железы теленка, среди которых имеются гомологичные динуклеотиды, содержащие цитозин и 5-метилцитозин. Его данные показывают, что в распределении цитозина и 5-метилцитозина наблюдаются значительные различия, т. е., что включение, по-видимому, происходит не по закону случая. Эти данные носят несколько предварительный характер, однако они показывают, что одной лишь комплементарности недостаточно для объяснения закономерного распределения оснований. Нет никаких явных стерических препятствий тому, чтобы 5-метилцитозин не мог включаться в тех положениях, которые обычно занимает цитозин, и Синсхеймер правильно указывает на возможность существования каких-то дополнительных путей в метаболизме нуклеотидов, которые позволят объяснить подобные отклонения от простых закономерностей.
Синсхеймер приводит также более серьезное возражение против простого комплементарного механизма удвоения ДНК. Фаг Т2 вместо 5-цитозина содержит 5-оксиметилцитозин, причем около 77% последнего связано с глюкозой. Многие исследования показали, что ДНК фага Т2 состоит из одного большого фрагмента, составляющего примерно 40% всей ее массы, и ряда более мелких фрагментов. Весь несвязанный 5-оксиметилцитозин обнаружен в большом фрагменте; это означает, что лишь около 60% его в большом фрагменте связано с глюкозой, тогда как все более мелкие фрагменты содержат глюкозу. Синсхеймер указывает: «Поскольку удвоение всех этих компонентов ДНК фага Т2 происходит в одной клетке и в одно и то же время, ограниченное включение глюкозы в большом фрагменте, по-видимому, нельзя отнести за счет какого-то недостатка метаболизма. Поэтому создается впечатление, что в процессе удвоения большого фрагмента механизм сам «знает», куда включить 5-оксиметилцитозин, содержащий глюкозу, а куда вставить незамещенный оксиметилцитозин, так как содержание глюкозы остается постоянным в течение многих поколений». Эти наблюдения. можно объяснить, предположив, что 5-оксиметилцитозин и его глюкозозамещенный аналог обладают при формировании цепи различными стерическими особенностями, благодаря которым ошибок в определении последовательности их расположения произойти не может. Возражения, которые выдвигает Синсхеймер в отношении простого комплементарного механизма, весьма полезны как для того, чтобы несколько охладить чрезмерный энтузиазм, так и сами по себе.
Некоторые из наиболее интересных данных, противоречащих гипотезе Уотсона и Крика, получены Стентом и его сотрудниками; они описали гибель фагов, меченных Р32, в результате радиоактивного распада. Однако эти опыты трудно изложить без предварительного знакомства с биологией фага.