Первыми известными для науки были ауксины a и b, изолированные Кеглем и сотрудниками из мочи (ауксин a) и из масла зародышей кукурузы и солода (ауксин b).
На наличии этих ауксинов в растениях базировались многие работы по фитогормонам в 30 и 40-е годы. Предпринятые позже самим Кеглем и его сотрудниками, а также другими исследователями более тщательные попытки получения ауксинов a и b закончились неудачей. Зединг и Раац, Беннет-Кларк, Джонс и Виланд с сотрудниками безуспешно искали ауксины a и b в растительном материале или моче. Группы Беннет-Кларка и Джонса пришли к выводу, что вся активность во взятых ими образцах мочи обусловлена β-индолилуксусной кислотой. Браун и Кегль с сотрудниками, синтезировав циклопентиловый аналог лактона ауксина b, доказали невозможность разрыва кольца лактона для получения кислоты — аналога ауксина b.
Наряду с этим появилось все больше доказательств широкого распространения в растениях p-и идол ял уксусной кислоты (ИУК) и некоторых других индольных соединений, обладающих ауксиновой активностью. Обнаруженная вначале в низших растениях (плазмолизат дрожжей и культура Risopus suitius) β-ИУК получила название гетероауксина. Позднее ее нашли в органах высших растений, особенно когда стали применять разделительную бумажную хроматографию в сочетании с биологической пробой. В настоящее время за β-ИУК признается ведущее положение среди индольных ауксинов и среди ауксинов вообще. Она является стандартом в определении ауксиновой активности.
Своему происхождению ИУК, по-видимому, обязана близкой к ней по строению аминокислоте — триптофану. Во всяком случае, большинство работ подтверждает эго предположение, хотя имеются также факты, ставящие под сомнение такую гипотезу.
Существует несколько гипотетических схем превращения триптофана в индолилуксусную кислоту обычно через триптамин или индолил-3-пировиноградную кислоту и индолил-3-ацетальдегид.
β-индолилуксусная кислота была обнаружена различными методами в тканях самых разнообразных групп растений высших и низших, но в качестве гормона она функционирует в высших растениях. Применение разных методов извлечения ауксинов из растительных тканей позволило установить существование двух форм ИУК в растениях: свободной и связанной.
Свободная индолилуксусная кислота подвижна и легко переходит в агар при определении диффузионным методом. Связанная ИУК соединена с белками, белковоподобными веществами или другими органическими веществами (например, полифенолами, сахарами, липоидами) и освобождается при извлечении методом экстракции только в процессе ферментативного или химического гидролиза.
Разделение на свободные и связанные ауксины является в значительной мере условным. Связанные ауксины в определенных условиях легко продуцируют свободные, а свободные, комплексируя с другими веществами, образуют связанные. Это относится в одинаковой мере и к живым растительным тканям и к вытяжкам из них. Так, тщательное изучение состава ростовых гормонов овсяных колеоптилей, проведенное рядом исследователей, показало наличие в них нестабильного и неактивного или со свойствами ингибитора комплекса, легко разрушающегося с образованием свободной β-индолилуксусной кислоты в процессе экстракции и хроматографирования.
Явление связывания характерно не только для индолилуксусной кислоты, но и для других нативных ауксинов, о чем свидетельствуют данные многих авторов и результаты нашего изучения естественных ростовых веществ у томатов.
Связанные ауксины в некотором смысле могут рассматриваться как предшественники свободных ауксинов, так как в результате определенных реакций они дают свободные ауксины.
Так, выделенный из тканей различных видов крестоцветных глюкобрассцин может быть в равной мере отнесен и к предшественникам и к связанным ауксинам, так как при разложении ферментом мирозиназой он дает нитрил ИУК, а если эта реакция идет при наличии аскорбиновой кислоты, то возникает и аскорбиген, из которого при щелочном гидролизе образуется ИУК и другие индольные соединения.
Нестабильность нативных ауксиновых комплексов наводит на мысль о том, что в тканях растений, очевидно, существует неустойчивое равновесие между свободными и связанными ауксинами, которое сдвигается в ту или иную сторону в зависимости от требований конкретной физиолого-биохимической «обстановки» и той функции, которую выполняют эти две различные формы гормонов.
Физиологическая и биохимическая роль свободной и связанной форм ауксинов в осуществлении регуляции ростовых процессов, по-видимому, различна. Свободная β-индолилуксусная кислота сосредоточена главным образом в молодых растущих органах и тканях: в верхушках стеблей и корней, в молодых растущих листьях и плодах, в тканях камбия, ответственного за вторичный рост, рост в толщину. Градиент концентрации свободной индолилуксусной кислоты и ростовых гормонов вообще, как правило, падает по мере удаления от центров активного роста. В стареющих и старых тканях, а также в семенах находят главным образом связанную индолилуксусную кислоту. Наблюдаемое иногда повышение содержания свободного ауксина в старых, давно закончивших рост листьях вызвано, вероятно, вторичным их высвобождением из связанного состояния.
Вентом и Тиманом на овсяном колеоптиле была показана прямая коррелятивная связь между скоростью роста и содержанием свободных ауксинов. Правда, позже Вент, работая с томатами, не обнаружил такой закономерности. Преимущество в содержании свободных ауксинов над связанными в молодых растущих тканях и связанных над свободными в окончивших рост стареющих тканях, а также высокое содержание свободных ауксинов в анормально растущих опухолевых тканях как будто бы указывает на большую значимость для роста свободных гормонов. Непосредственное участие связанных ауксинов в регулировании роста ставится под сомнение многими исследователями. Высказывалось предположение, что некоторые из комплексов, а именно ауксин-белковые могут служить в качестве резерва, запаса ауксинов, например в семенах. Эго предположение подкрепляется изучением динамики ауксинов в развивающихся и прорастающих семенах. Вместо высокого содержания свободных ауксинов в развивающихся, незрелых семенах отмечается почти полное их отсутствие и высокое содержание связанных ауксинов в зрелых семенах, которое с началом прорастания опять сменяется резким возрастанием содержания свободных ауксинов.
Наряду с воззрениями, приведенными выше, у различных исследователей все чаще возникает мысль об активности связанных ауксинов в осуществлении контролируемых ростовыми гормонами процессов роста. Так, Боннер и Фостер, исследуя методом кинетического анализа рост овсяного колеоптиля, вызываемый ауксином, предложили гипотезу, согласно которой ауксин, проникая в колеоптиль, образует там некий комплекс, концентрация которого определяет скорость роста, а Френсон в серии исследований представил доказательства тому, что легко экстрагируемый свободный ауксин в определенных условиях не является активным в отношении роста.
Изучая влияние гиббереллина на рост и содержание свободных и связанных ауксинов в этиолированных гороховых проростках (карликовый сорт), мы обнаружили прямую коррелятивную зависимость между интенсивностью роста проростков и концентрацией связанных ауксинов в них; концентрация свободных ауксинов была практически одинаковой в проростках разной высоты.
С другой стороны, наши опыты с влиянием условий азотного питания на рост и содержание ауксинов в молодых растениях томатов показали противоположную ростовую чувствительность их корней и стеблей именно к свободным ауксинам, в то время как концентрация связанных ауксинов в более интенсивно, по сравнению со стеблями, растущих корнях голодавших по азоту томатов увеличивалась по мере углубления азотного голодания.
Бентли критически рассмотрел данные по вопросу о значении для роста каждой из форм ауксинов (свободной и связанной) и пришел к выводу о вероятной физиологической активности связанных ауксинов и неактивности свободных. Кроме того, он высказал предположение, что внесенная извне, так же как и нативная, ИУК не может быть активной в клетке до тех пор, пока она не превратится в какой-то другой активный агент или комплекс.
Имеющиеся в этом вопросе противоречия возникают, очевидно, в результате отсутствия четкого разграничения понятий «свободные» и «связанные» ауксины. Едва ли у кого-нибудь возникнут сомнения относительно неактивности связанных ауксинов в созревших сухих семенах и в других покоящихся органах, богатых запасными малоподвижными соединениями. Здесь ауксины «связаны», по-видимому, весьма прочными химическими связями, требующими для своего разрушения активной «работы» ряда в основном протеолитических ферментов. Связывание ауксинов, обнаруживаемых в листьях, стеблях, развивающихся почках, носит, но всей вероятности, кратковременный и поэтому относительно непрочный характер. Такие связанные ауксины являются или своего рода «подручным материалом» для быстрого образования нужного количества молекулярно свободного гормона, или уже включившимися (вместе с другими соединениями) в интимные процессы ростового метаболизма комплексами (см. раздел о механизме действия). Количество таких связанных ауксинов меняется в том же направлении, что и количество свободных ауксинов. О существовании гипотетической активной связанной формы ИУК, не идентичной запасной связанной ИУК, высказывал предположение Френсон. Точный ответ на вопрос о сути и значении для роста двух форм ауксинов будет найден вместе с решением вопроса о механизме действия этих фитогормонов. Пожалуй, одно только положение не вызывает сомнений, а именно, что внесенный извне ауксин, в том числе и ИУК, претерпевает в растениях какие-то более или менее сложные, но относительно быстрые превращения, которые делают его физиологически активным в ростовых процессах.
Интенсивное изучение химической природы ауксиноподобных веществ, выявленных при биологическом и химическом проявлении хроматограмм экстрактов из большого разнообразия растительных тканей, привело к открытию еще нескольких нативных ауксинов индольного характера.
Это, во-первых, 3-иидолилацетонитрил (ИАН), выделенный из тканей растений семейства крестоцветных, где он находится в свободном состоянии или образуется при разрушении глюкобрассицина. Кроме того, по разным источникам, не всегда отвечающим требованиям точной идентификации, ИАН обнаружен в растениях других систематических групп.
Ростовая активность ИАН в классическом ауксиновом тесте роста в длину отрезков овсяных или пшеничных колеоптилей или в тесте отрезков мезокотилей овса равна или значительно превышает активность ИУК. Однако рост тканей других растений, применяемых в качестве биопроб на ауксины, например гороха (pea streight-growth test, pea curvature test) и кукурузы (split maize coleoptile test), не стимулируется нитрилом.
Столь же нестабильной при хроматографировании оказывается 3-индолилпировиноградная кислота (ИПирК). По сведениям Бентли и сотрудников, синтезированная или чистая ИПирК полностью, а по результатам нашей проверки — частично разрушается при разгонке аммиачным растворителем, образуя при этом многие, в том числе и биологически активные соединения.
Вследствие применения аммиачной хроматографии большинство сведений об идентификации ИПирК в растительных тканях являются сомнительными. О выделении ИПирК из ацетонового экстракта семян кукурузы с помощью не вызывающих ее разложения хроматографических растворителей сообщалось недавно.
Синтетическая ИПирК, по данным Бентли и сотр., в концентрациях 1—10 мг/л проявляет низкую, но заметную активность в овсяном тесте, эквивалентную приблизительно 1 % активности ИУК, и тормозит рост корней кресс-салата.
Высокая ауксиновая активность в тесте отрезков мезокотилей и колеоптилей овса присуща этиловому эфиру ИУК — этилиндолацетату (ЭИАц). Идентификация ЭИАц очень затруднена, так как, во-первых, он может появляться в этаноловых экстрактах вследствие легкой эстерификации имеющейся там ИУК и, во-вторых, в обычно применяемых растворителях он идет в одной зоне с ИАН и другими неидентифицированными индольными ауксинами. Тем не менее имеются сведения, требующие, однако, уточнения, о его нахождении в тканях некоторых растений.
Различия в характере ростовых реакций тканей на действие ИАН обусловлено способностью тех или иных растительных тканей превращать индолилацетонитрил в индолилуксусную кислоту. Это было продемонстрировано опытами Сили и сотрудников. Отсюда следует, во-первых, что индолилацетонитрил не является таким универсальным ауксином, как индолилуксусная кислота, и, во-вторых, что ткани разных растений, даже близко родственных (например, пшеницы и кукурузы), обладают отличным по отношению к индольным ауксинам биохимическим аппаратом.
Существование в растениях другого нативного ауксина 3-индолилацетальдегида (ИААль) относительно гипотетично вследствие того, что была показана крайняя неустойчивость чистого синтетического или предполагаемого нативного препарата.
Ауксиновая активность ИААль слабее, чем ИУК, и обусловлена образованием β-ИУК в растворах альдегида. Сам по себе альдегид действует, очевидно, как ингибитор. Из-за своей неустойчивости ИААль практически не поддается выявлению с помощью хроматографических методов. Тем не менее Дюбоше и сотрудники сообщают об идентификации ИААль в метанольных экстрактах корней чечевицы с помощью тонкослойной двумерной хроматографии и проявления в нескольких специфических реактивах. Немного раньше, применив хроматографию в насыщенном водой гексане, Ларсен подтвердил свою первоначальную идентификацию ИААль в вытяжках из гороха.
Описанными выше соединениями не исчерпывается список нативных индольных веществ. Приводится перечень многих других, в подавляющем большинстве неактивных, как ауксины, индолпроизводных, обнаруженных различными, часто не вполне точными методами в тканях растений. О роли и значении этих соединений для регулирования роста трудно пока сказать что-либо конкретное, кроме того, что многие из них, по-видимому, участвуют в процессах биогенеза и разрушения активных индольных ауксинов. Чрезвычайно низкие концентрации в растительных тканях индольных соединений, обладающих и не обладающих ауксиновой активностью, сильно затрудняют их выявление и идентификацию. Поэтому не так уж часто встречаются работы, в которых представлены данные о химическом составе нативных ауксинов исследованных растений. Кроме того, есть все основания предполагать о существовании ауксинов неиндольного характера — активных в биотестах соединений, но с иной химической характеристикой.
Кросби и Влитос, например, обнаружили два таких соединения в эфирных и спиртовых экстрактах из листьев и меристематической ткани табака. Одно из них было идентифицировано как спирт l-докосанол, а другое — как натриевая соль насыщенной жирной кислоты с длинной цепью.
В одном из последних сообщений была доказана неиндольная природа так называемого «цитрусауксина», найденного в плодах разных растений и проявлявшего типичную ауксиновую активность в таком характерном ауксиновом тесте, как тест изгиба овсяных колеоптилей.
Физиологическое действие ауксинов выражается ярче всего в стимулировании роста клеток в длину. Все рассмотренные нами выше нативные ауксины в различной мере обладают этим свойством, но наиболее ярко оно выражено у ИУК. Это обстоятельство, а также почти повсеместное распространение ИУК в тканях различных растений и четко выраженная полярность передвижения дали основание некоторым исследователям утверждать, что ИУК является единственным нативным ауксином. Изучение обмена других индольных ауксинов, например ИАН, ИААль, ИПирК, в растительных тканях, в том числе и в тканях биотестов, показало, что их ростовая активность обусловлена первоначальным превращением в ИУК. Ставится под сомнение и сама «нативиость» происхождения отдельных активных индольных соединений, которые во многих случаях являются артефактами процессов выделения (экстракция, хроматография) ауксинов и растительных тканей.
Является ли правильной точка зрения об исключительной роли ИУК, покажут дальнейшие исследования, особенно в области выяснения механизма действия ауксинов. Однако и сейчас уже ясно, что нельзя не учитывать другие индольные вещества, многие из которых являются промежуточными в синтезе ИУК из триптофана.