Чтобы оценить патогенность грибов, изолированных из семян, проводят заражение почвы, инфицирование проростков или всходов в фазе 1—2 листьев.
В качестве примера приведены способы заражения проростков на агаровых пластинках и заражения корней всходов путем обмакивания в суспензию спор или наложения заросших мицелием кусочков агара на корневую шейку. Можно также заражать семядольные листья или первый настоящий лист, нанося споровую суспензию опрыскиванием или с помощью кисточки.
Заражение проростков ржи Rhizoctonia sp., на агаровых пластинках. Оценку патогенности изолированных из семян свеклы штаммов Rhizoctonia для ржи проводят следующим образом. В чашки Петри диаметром 90 мм со стандартной питательной средой (например, солодовым агаром) высевают по одному из изучаемых штаммов гриба. Как только гриб закроет всю поверхность среды, на ней раскладывают зерна ржи (4×4), поверхностно тщательно обеззараженные сулемой или каким-нибудь протравителем и многократно промытые стерильной водой. Чашки закрывают, на два дня помещают в термостат при комнатной температуре и затем оставляют на свету, чтобы ускорить развитие проростков; через шесть дней можно проводить оценку. Контролем служат аналогично обработанные семена ржи на незасеянной питательной среде. Патогенные штаммы вызывают более или менее сильное побурение проростка и его корешков.
Заражение корней проростков путем погружения в суспензию спор. Проростки выращивают в стерильных условиях, например во влажной камере, до появления корней. Затем корни обмакивают в суспензию спор, проростки помещают на ночь во влажную камеру и на следующий день высаживают. В качестве субстрата используют дезинфицированную почву или стерильный песок с питательным раствором. Песок имеет преимущество, так как при появлении на листьях признаков пожелтения, увядания или отмирания растение легче вынуть, отмыть субстрат и провести оценку.
Заражение корней или гипокотиля проростков путем наложения агаровых пластинок с мицелием гриба. Если изолированные из семян грибы не образуют спор in vitro, заражение для первичной оценки патогенности проводят с помощью заросших грибом пластинок агара, накладывая их на корни или гипокотиль проростка. Растения выращивают в стерильной почве. Для этого особенно пригодны гончарные плошки, в которых растения стоят на расстоянии 4—5 см друг от друга, так чтобы раскладка мицелия проходила свободно. Кусочки агара с изучаемыми изолятами размещают в одних случаях на корнях, в других—на гипокотиле: нужную часть растения осторожно освобождают от почвы с помощью препаровальной иглы, накладывают агаровую пластинку мицелием вниз, засыпают почвой и осторожно поливают. Для контроля те же части нескольких растений накрывают чистыми пластинками агара.
Примечание. Агар не должен полностью охватывать выбранную часть растения, иначе при его высыхании образуется перетяжка, а это приведет к отмиранию выше расположенных частей растения и к симуляции успешного заражения.
Заражение семядольных листьев фасоли Colletotrichum lindemuthianum. Гриб культивируют в течение трех недель на агаре Матурса, чтобы получить достаточное количество спор. Семена фасоли высаживают в стерильную почву (по 4 на горшок диаметром 10 см), примерно через 9 дней появляются полностью развившиеся семядольные листья, и можно проводить заражение. Для этого акварельную кисточку обмакивают в споровую суспензию концентрацией 107 конидий/мл воды и наносят ее на верхнюю и нижнюю сторону листьев. Горшки накрывают на два дня пластиковым колпаком для создания высокой влажности воздуха и выдерживают при 20 °С и 14-часовом освещении (15 000 лк). После снятия колпаков растения оставляют еще на четыре дня при тех же условиях, а затем проводит оценку.
Проростки и молодые растения в фазе 1—2 листьев пригодны не только для оценки патогенности возбудителей, передаваемых семенами, но и для проведения искусственного заражения всеми патогенами, встречающимися на надземных частях растения. Исключение представляют виды со специфическими путями инфицирования, например пыльная головня ячменя (Ustilago nuda) или спорынья (Claviceps purpurea).
Из огромного числа возможных методов заражения приведены только отдельные примеры.
Для заражения всходов зерновых культур возбудителем глазковой пятнистости и ломкости стеблей (Pseudocercosporella herpotrichoides) методом Мейсера используют солому, инфицированную мицелием. Для приготовления инфекционного материала свежевыделенные изоляты P. herpotrichoides выращивают на картофельно-декстрозном агаре с добавлением стрептомицина. Затем агаровые диски диаметром 7 мм, поросшие мицелием, переносят в картофельно-декстрозный питательный раствор и в течение 4 недель выращивают культуру гриба на качалке.
Заражение по Мейсеру. Одновременно заготавливают отрезки соломы, разрезая острой бритвой примерно одинаково крупные стебли зрелых растений пшеницы и особенно следя за тем, чтобы отрезки не расщеплялись. В течение суток их замачивают в 5% — ной декстрозе, налитой в колбы емкостью 500 мл, затем декстрозу сливают и 40 мин проводят автоклавирование. После него колбы заполняют жидкой культурой гриба, через 24 ч отстоявшийся раствор сливают и отрезки соломы инкубируют 4—6 дней при комнатной температуре.
Заражение проростков, выращенных в горшках, проводят в теплице. На колеоптили, достигшие в длину 1—1,25 см, надевают цилиндры из инфицированных отрезков соломы. Горшки примерно до верхней границы цилиндра заполняют песком и хорошо поливают, чтобы поддерживать влажность отрезков соломы и предотвратить их смещение первым настоящим листом. Кроме того, при ограниченном освещении замедляется образование конидиеносцев и конидий, следовательно, снижается возможность неконтролируемого развития дальнейших инфекций. Растение помещают на 6—8 недель в холодное помещение, в конце этого периода инкубации проростки осторожно вынимают и проводят учет поражения.
Примечание. Этот очень трудоемкий метод позволяет довольно точно дозировать инфекционный материал и служит в первую очередь для определения устойчивости селекционного материала. Исследования по установлению патогенности свежевыделенных изолятов гриба, а также изучение изменчивости этого признака у изолятов, длительное время культивируемых in vitro, проводятся более простыми методами.
Метод проращивания в рулонах. Данный метод, разработанный Фрауэнштайн и Роскотеном, пригоден для оценки на устойчивость к Pseudocercosporella herpotrichoides (хотя по точности он уступает методу Мейсера), а также для проведения испытаний на патогенность. Особое преимущество проращивания в рулонах — это простота его проведения.
Полосы фильтровальной бумаги (№ 232, 120 г/м2) размером 06X16 см нумеруют, погружают в чистую водопроводную воду и развешивают для стекания воды. Зерна пшеницы тщательно моют в проточной воде, поверхностно дезинфицируют 0,1%-ной сулемой или каким-либо ртутьсодержащим протравителем, промывают стерильной водой и раскладывают рядами на бумажные полосы из расчета 80—100 зерен на каждую полосу. Примерно на 1 см выше семян помещают полоски агара шириной 1 см, заросшие агрессивным штаммом P. herpotrichoides (солодовый агар, трехнедельная культура), и накрывают увлажненной полимерной пленкой (100X8 см). За счет этого сдерживается разрастание корней по фильтровальной бумаге и облегчается последующее разворачивание рулона.
Готовую полосу скручивают в рулон. Нижний его край загибают примерно на 1 см и зажимают двумя скрепками (чтобы предотвратить разворачивание, на рулон надевают резинку), верхний конец остается открытым. По нескольку рулонов, например по три, ставят в пленочные пакеты (по возможности отверстиями для вентиляции), а пакеты размещают в проволочных корзинах. Чтобы ускорить прорастание, рулоны выдерживают 48 ч при комнатной температуре (около 20 °С) и затем 10 дней при 5°С в неосвещенной холодильной камере. В течение следующих 20 дней рулоны хранят с 8 до 16 ч в очень светлой комнате (желательно у окна) при 20 °С и с 16 до 8 ч — в холодильной камере (в темноте) при 5°С. Эти условия очень благоприятны для заражения. Через 32 дня из верхнего конца рулона вырастают растения. Рулоны разворачивают и проводят оценку растений по четко выраженным симптомам.
Заражение суспензией спор. В этом опыте применяют проростки в фазе 1—2 листьев, выращенные в почве или в питательном растворе. Для оценки патогенности используют только внешне здоровые растения восприимчивых сортов, при каждом испытании необходимы контрольные (незараженные) растения. Суспензию спор наносят кисточкой или в большинстве случаев проводят опрыскивание, используя в зависимости от объема опыта простой пульверизатор или различные опрыскиватели.
Растения должны быть полностью покрыты мелкими каплями. Очень целесообразно во время опрыскивания ставить сосуды с растениями на какую-нибудь легко поворачиваемую поверхность (например, плоское блюдо). Чтобы обеспечить успех заражения, надо стереть пальцами часто имеющийся на листьях восковой налет. В целом же оценку патогенности следует проводить с помощью интактных растений. Заражение через поранения, особенно факультативными паразитами, не всегда позволяет дать четкое заключение о патогенности.
Исключительное значение имеет концентрация споровой суспензии, ее всегда необходимо определять соответствующим способом. В одних случаях (например, при работе с уредоспорами ржавчинных грибов) слишком высокая концентрация действует отрицательно на проявление симптомов: на листьях развиваются некрозы, типичные симптомы отсутствуют. В других случаях растения оказываются толерантными к слишком слабой концентрации суспензии (симптомы также не появляются). Суспензия опор, как правило, должна быть свежеприготовленной и по возможности быстро использоваться. Это прежде всего относится к суспензиям уредоспор, которые при длительном хранении выделяют определенные токсины и подавляют развитие друг друга. Для большинства фитопатогенных грибов действует общее правило: активность внедрения в клетки растения-хозяина ослабевает с удлинением ростковой трубки. По этой причине длительное хранение суспензии спор также нежелательно. В исключительных случаях, например, если влажность воздуха после опрыскивания может быть неустойчивой (заражение в поле), суспензию вносят после того, как начнется видимое под микроскопом прорастание спор. Это позволяет сократить период становления инфекции.
Чтобы уменьшить оседание спор на стенках опрыскивателя, в суспензию добавляют поверхностно активные вещества (детергенты). Для этого наиболее пригодны специальные торговые препараты, например твин 20, а также добавки к пестицидам — смачиватели и растекатели, например фит и др., несколько капель которых вносят в споровую суспензию. В этих случаях, однако, необходимо
предварительно проверить, не подавляют ли эти вещества прорастание спор. После нанесения суспензии спор растения выдерживают 24—48 ч при очень высокой влажности воздуха, а в дальнейшем — при оптимальных для каждого возбудителя условиях освещенности и температуры до образования симптомов.
Определение концентрации споровой суспензии. Для определения концентрации споровой суспензии используют счетные камеры, например камеру Тома. Она состоит из предметного стекла с несколькими желобками для стока и одним или двумя четырехугольниками-насечками с длиной сторон 1 мм и глубиной 0,1 мм, которые продольными и поперечными штрихами разделены на 400 равных клеточек. Этим обеспечивается лучший просмотр и облегчается подсчет. Суспензию спор хорошо перемешивают, несколько капель наносят на предметное стекло и закрывают специально подогнанным по размеру счетного поля покровным стеклом. Лишняя вода стекает по желобкам. Затем проводят подсчет спор, находящихся в четырехугольнике. Если споры расположены на краю счетного поля и лишь частично в его центре, подсчет проводят по правому и верхнему краю, но учитывая споры на левом и нижнем краю, или наоборот. Поскольку камера Тома имеет глубину 0,1 мм, ее объем соответствует 0,1 мм3 (длина 1 мм, ширина 1 мм, глубина 0,1 мм). Подсчитанное число спор умножают на 10 000, получая число спор на 1 мл споровой суспензии, т. е. ее концентрацию. Подсчет повторяют не менее трех раз, получая затем среднее значение.
Заражение путем опрыскивания суспензией мицелия. Патогенность возбудителей болезней, образующих in vitro мало спор, можно оценивать с использованием суспензии мицелия.
Примером служит заражение зерновых культур грибами рода Drechslera (син. Helminthosporium), вызывающими пятнистости листьев. Возбудителя сначала культивируют 8—10 дней на биосолодовом агаре в чашках Петри диаметром 90 мм. Когда культура гриба покроет всю поверхность чашки, начинают готовить суспензию. Для этого культуры в чашках Петри разрезают вдоль и поперек на кусочки размером 5X5 мм, помещают в бытовой миксер, доливают 200 мм водопроводной воды и получают суспензию измельченного мицелия. Добавив еще 200 мл водопроводной воды, ее еще раз хорошо перемешивают и фильтруют через слой марли. Перед применением, которое должно произойти как можно быстрее (инфекционным материалом служит мицелий, заново развивающийся на местах срезов и разрывов), суспензию можно разбавить водопроводной водой (1:5). Для внесения используют опрыскиватель емкостью 1,5 л с наконечниками максимального диаметра. Данный метод пригоден и для массового заражения, но суспензию вносят с помощью ранцевого опрыскивателя (5 или 10 л). В этом случае испытание лучше всего проводить осенью. Растения можно высеять в ящики и весной перенести в парник. Для поддержания высокой влажности парники укрывают рамами. Оценку проводят после появления симптомов, т. е. примерно через 14 дней.
Заражение опыливанием спорами. Этот способ применяют преимущественно в работах с возбудителями настоящих мучнистых рос и ржавчинными грибами, для других грибов — только в исключительных случаях. При заражении всходов зерновых культур Erysiphe graminis чаще всего оценивается устойчивость, а не патогенность, или проводится идентификация рас. Растения выращивают до фазы 1—2 листьев. Перед заражением растения часто срезают до первого листа, причем не для активизации инфекции, а для облегчения последующей оценки (необязательный прием). Затем растения опрыскивают водой и стряхивают на них конидии с сильно пораженных растений. В первое время необходимо поддерживать повышенную влажность, в последующий период число поливов сокращают, иначе задерживается развитие симптомов. У слишком переувлажненных растений участки поражения выглядят часто как зеленые островки на желтеющих листьях. Оптимальный температурный режим — 18—20 °С.
При заражении мучнистой росой опыливание дает лучшие результаты, чем опрыскивание суспензией спор. Однако заражение зерновых ржавчинными грибами путем опыливания уредоспорами не дало преимущества в сравнении с внесением суспензии. Чтобы инфекция не была слишком сильной, уредоспоры смешивают с тальком в соотношении 1:5—1:10. Показано положительное влияние предварительного опрыскивания растений 0,1%-ным агаром или водопроводной водой с добавлением прилипателей, причем по воздействию на прорастание спор агар оценивается выше, чем имеющиеся в продаже прилипатели. При небольшом числе растений с листьев целесообразно удалить восковой слой. После увлажнения растения опудривают с помощью обычного пульверизатора. Для ржавчинных грибов особенно важно поддерживать высокую влажность в течение последующих 24—48 ч.
Вместо молодых растений для заражения можно использовать нарезанные кусочки листьев — метод, к которому особенно часто прибегают при работе с возбудителями ржавчин, ложных мучнистых, а иногда и настоящих мучнистых рос. Для точной оценки важно, чтобы кусочки листьев хорошо сохранялись до появления симптомов, в чем и заключается причина ограниченности применения методов такого типа. Их результативность в значительной мере зависит от окружающей среды, например от света и температуры, поэтому они пригодны лишь тогда, когда факторы среды можно точно регулировать и постоянно поддерживать (в фитотроне или в климатической камере). Для сохранения кусочков листьев используют бензимидазол (концентрация 30—50 мг/л) в виде раствора или добавки к водному агару. Раствор наливают в сосуд с листьями или кусочками листьев, которые удерживаются с помощью натянутой сетки. Для заражения путем стряхивания спор целесообразнее горизонтальное положение листьев. В этом случае листья раскладывают на пропитанном бензимидазолом поролоне в пластиковых чашках. Твердую поверхность обеспечивает также водный агар с бензимидазолом в чашках Петри.
После опрыскивания кусочков листьев споровой суспензией или опыливания спорами чашки на 2—3 дня закрывают стеклянными пластинками или крышками от чашек Петри и размещают в климатроне, а при его отсутствии — в светлом помещении с постоянной температурой 18—20 °С. Под воздействием прямого солнечного света или искусственного освещения температура под стеклянными крышками повышается, а этого нужно избегать. В опытах с мучнисторосяными грибами через 3 дня под стеклянные крышки подсовывают деревянные этикетки или какие-либо палочки для вентилирования. Ржавчинные грибы и возбудители ложной мучнистой росы переносят длительную высокую влажность воздуха лучше, но и в этом случае для сохранения кусочков листьев она должна быть умеренной.
Заражение отдельных частей растений. Вместо целого растения можно заражать отдельные его части, например корни, клубни, отрезки побегов, плоды (ср. заражение клубней картофеля Phytophthora infestans или яблок Phytophthora cactorum). Если свести воедино методы, описанные в специальной литературе для разных возбудителей болезней, то можно рекомендовать следующие основополагающие правила заражения всех отдельных частей растений: 1) Использование внешне здоровых частей растений. 2) Поверхностное дезинфицирование частей растений с последующим тщательным промыванием стерильной водой. 3) Очень тщательное проведение работ, по возможности в стерильных условиях. 4) Заражение споровой суспензией путем погружения, нанесения капель или опрыскивания, нанесения или введения мицелия или частиц больных растений. 5) Помещение зараженных частей растений во влажную камеру соответствующего размера. 6) Содержание зараженного материала в условиях, оптимальных для развития возбудителя, до появления симптомов.
Заражение растений в полевых условиях. Для оценки на патогенность заражение растений в поле проводят лишь в исключительных случаях. В этих условиях особенно трудно поддерживать необходимую влажность воздуха на протяжении всего периода, нужного для развития инфекции. В качестве примера можно привести заражение зерновых возбудителем спорыньи (Claviceps purpurea). При культуре на зернах гриб через 2—3 недели образует массу конидий, что дает возможность к моменту заражения приготовить суспензию спор концентрацией 106 конидий/мл. Инфекция должна попасть в раскрытые цветки, поэтому их смачивают водой и опрыскивают суспензией спор. Принятое в опытах с рожью накалывание основания зерновки иглой, смоченной в суспензии, не пригодно для оценки на патогенность; его используют для массового получения рожков спорыньи.
После нанесения споровой суспензии колос закрывают пленочным пакетом, в который вложена мокрая вата для поддержания высокой влажности и защиты стебля от повреждения при завязывании пакета. Для завязывания используют тонкий шнур или гибкую проволоку, одновременно закрепляя их на колышке для подвязки, предохраняющем изолированный колос от поникания. Через 2—3 дня пакет можно удалить. Зараженные колосья маркируют, чтобы отличить их от позднее зацветающих, незараженных побегов.