Поскольку установлено, что у взрослых млекопитающих в клетках кожи и роговицы, имеющих эктодермальное происхождение, после обработки их глицерином и хранения при низких температурах восстанавливается нормальная физиологическая активность, возникло предположение о возможности хранения таким же образом нервных клеток и волокон.
Люйет и Гонсалес обнаружили, что нервная ткань мозга куриного эмбриона, обработанная 60-процентным раствором этиленгликоля, переживала замораживание в жидком азоте, на что указывал рост нервных волокон в культурах тканей, приготовленных после оттаивания.
Возможность восстановления нормальной функции нервных клеток, волокон и синапсов млекопитающих после замораживания и оттаивания очень подробно изучал Паско. Он использовал препараты верхнего шейного ганглия крысы вместе с его пре — и постганглионарными нервами. Препарат монтировали вместе с электродами, чтобы регистрировать потенциалы действия от ганглиев и волокон до и после замораживания. Охлаждение и оттаивание производили тремя способами. Первый заключается в том, что препарат погружали в пробирку (12 X 0,8 см), содержащую 2 мл раствора Кребса или раствора Кребса с глицерином, пробирку запаивали и охлаждали до нужной температуры, после чего отогревали в воде с температурой —40°. Согласно второму способу, препарат прикрепляли к маленькой стеклянной гирьке и опускали в пустую пробирку; пробирку запаивали и погружали в сосуд с замораживающей смесью. В течение 2 мин температура препарата понижалась до —40°, а затем примерно за 4 мин до —79°. Препарат оттаивали, вскрыв пробирку и перенеся гирьку в раствор Кребса или в раствор Кребса с глицерином при температуре 38°. Процесс оттаивания длился 3 сек. По третьему способу препарат, зажав между двух листков алюминиевой фольги, погружали в изопентан с температурой —76°, а затем согревали в воде при +40°. Охлаждение и оттаивание осуществляли очень быстро, но не настолько, чтобы вызвать витрификацию воды вместо ее кристаллизации.
Верхние шейные узлы крысы, охлажденные в растворе Кребса и выдерживавшиеся в течение 5 мин при различных температурах ниже 0° в отсутствие глицерина, согревали, а затем проверяли их физиологическую активность. Оказалось, что потенциал постганглионарных волокон, вызванный раздражением преганглионарных волокон, после охлаждения препарата ганглия до —10° и оттаивания мало отличался от потенциала, зарегистрированного перед охлаждением. В препаратах, охлажденных до температур от —10 до —15°, реакция была уменьшена. После охлаждения до —15° реакция на раздражение преганглионарного нервного волокна отсутствовала, хотя в одном опыте при непосредственном раздражении постганглионарного нервного волокна был вызван небольшой потенциал действия. Препараты, не обработанные предварительно глицерином, не реагировали на электрическое раздражение после охлаждения до —79°, независимо от применявшегося метода замораживания и оттаивания. У них изменялся внешний вид; они казались прозрачными, и можно было не сомневаться в наличии необратимых повреждений.
Первые попытки обрабатывать ганглий и его пре — и постганглионарные волокна путем погружения их в глицерин привели к полной потере возбудимости и сморщиванию препарата, как если бы его подвергли высушиванию. Эти явления, однако, были обратимы. После отмывания в растворе Кребса препарат приобретал прежний нормальный вид и возбудимость восстанавливалась. Пропитанные глицерином ганглии не переживали охлаждения до —79° (любым методом). На основании полученных данных можно было предположить, что оболочки нервов и капсулы ганглиев непроницаемы для глицерина. Когда эти оболочки удаляли, а концентрацию глицерина постепенно повышали, перенося препарат с интервалом в 5 мин в растворы, содержащие 5—10% и 10—15% глицерина, проведение возбуждения и передача его через синапсы замедлялись, а потенциал действия падал, но никогда не исчезал полностью. Величина потенциала действия и скорость распространения нервных импульсов приходили в норму через 20—30 мин после окончания постепенного удаления глицерина и возвращения препарата в раствор Кребса. Ганглии, выдержанные в течение 30 мин (для уравновешивания) в растворе Кребса с добавлением 5, 10 или 15% глицерина, охлаждали до —79° тремя способами. После их оттаивания глицерин медленно удаляли. Затем препараты опять помещали в раствор Кребса и через различные промежутки времени вновь исследовали их свойства, сравнивая электрические реакции с реакциями, зарегистрированными до обработки. Оказалось, что 5—10-процентный раствор глицерина мало защищал нервные ткани. Быстрое охлаждение на алюминиевой фольге неизменно вызывало повреждения, а в некоторых случаях были отчетливо видны такие признаки механической травмы, как раздавливание или разрыв нервов. В противоположность этому в ганглиях и нервах, обработанных после удаления капсулы и оболочек раствором Кребса с добавлением 15% глицерина и затем медленно охлажденных до —79°, после оттаивания физиологические функции восстанавливались. Не наблюдалось большой разницы между потенциалами действия препаратов, которые во время замораживания были погружены в среду, содержащую глицерин, и препаратов, предварительно обработанных глицерином и подвергшихся замораживанию в пустой пробирке. Первыми восстановились потенциалы действия в пре — и постганглионарных волокнах. Проведение возбуждения через ганглий, проверявшееся по высоте потенциала действия в постганглионарном нерве, вызванного раздражением преганглионарного нерва, восстановилось позднее. Реакции постепенно увеличивались в течение 45 мин—1 час после удаления глицерина и возвращения препарата в раствор Кребса, в котором он и находился до тех пор, пока потенциалы действия, зарегистрированные от ганглия или его нервов, не становились идентичными тем, которые наблюдались до замораживания.
Хранение при температуре —76° в течение 24 час не оказывало заметного вредного действия на ганглии, медленно охлажденные любым из двух способов в присутствии 15% глицерина. Потенциалы действия, зарегистрированные от пре — и постганглионарных нервов, а также потенциалы действия, проходящие через ганглий, не изменялись ни по амплитуде, ни по продолжительности. Не ухудшалась также способность передачи через синапсы ганглия быстрой серии импульсов. Однако препараты, хранившиеся более 1 дня при температуре —76°, полностью не восстанавливались, о чем можно было судить по ослаблению реакций на электрические раздражения. Меньше была амплитуда и потенциалов действия в препарате, который хранили 21 день при —76°.
Полученные данные представляют интерес во многих отношениях. Наиболее важно, что препарат ганглия оказался необычайно устойчивым к замораживанию без обработки его глицерином. В то время как эритроциты гемолизировались при замораживании в течение 5 мин при температуре от —3 до —5°, верхний шейный ганглий крысы, будучи замороженным при —4 или —5°, не получал тяжелых повреждений. Температура, при которой быстро наступали изменения ткани, точно не установлена. Тяжесть повреждений увеличивалась по мере снижения температуры от —10 до —15° (при продолжительности воздействия также 5 мин). Даже после хранения в течение 12 час при —15° в одном препарате в постганглионарном нерве был вызван небольшой потенциал действия. Следовательно, механизм повреждения нервных волокон и ганглия во время замораживания и оттаивания, по-видимому, не вполне соответствует тому, который имеет место при замораживании эритроцитов. Нервные ткани, вероятно, исключительно устойчивы к действию концентрированных солевых растворов. Препараты ганглия переносили более быстрое охлаждение, чем сперматозоиды быка. Очень быстрого охлаждения они не переживали, возможно вследствие механической травмы. Отсюда возник вопрос, не наступает ли в нервной ткани тот вид физико-химической неустойчивости, который наблюдается у сперматозоидов быка и который можно вызвать в эритроцитах очень быстрым охлаждением. Паско полагает, что нервные волокна и ганглии при очень быстром охлаждении повреждаются главным образом в результате механического стресса. Интересно отметить, что капсула ганглия и оболочки нервов препятствовали проявлению защитного действия глицерина. Следовательно, можно предположить, что они непроницаемы для глицерина. Осмотическая дегидратация не повышала устойчивости нервных волокон и синапсов к замораживанию. Все полученные данные показывают, что для того, чтобы оказать защитное действие при очень низких температурах, глицерин должен достигать клеток и волокон, а возможно, и проникать в них. Паско производил перфузию интактных крыс растворами глицерина с постепенно возрастающей концентрацией и готовил препараты верхних шейных ганглиев, не удаляя капсулы ганглия и оболочек нервов. После охлаждения препаратов до —76° и последующего оттаивания, а также после удаления глицерина проведение возбуждения в постганглионарном нерве и передача его через ганглий не нарушались. В преганглионарном же нерве, в препаратах, обработанных глицерином посредством перфузии интактного животного, никогда не наблюдалось проведения возбуждения. По-видимому, преганглионарный нерв повреждался при удалении глицерина in vitro. Отсюда возникло предположение, что оболочка нерва препятствовала диффузии молекул глицерина из нервных волокон, допуская в то же время проникновение в них молекул воды. Наступающий в результате этого отек наносил волокнам механическую травму.
На основании опытов с перфузией, а также результатов замораживания изолированных ганглиев, обработанных глицерином in vitro, можно прийти к выводу, что такого рода повреждение нервной ткани, возможно, не должно быть лимитирующим фактором при попытке оживить интактное животное, перфузированное глицерином, охлажденное до очень низкой температуры и затем согретое.