Для культивирования микроорганизмов применяют различные среды, как комплексные, так и синтетические.
Одним из факторов, определяющих пригодность той или иной среды для микроорганизма, является ее активная кислотность, характеризуемая величиной pH.
Установлено, что активная кислотность оказывает влияние на рост культуры в зависимости от двух факторов. Первый фактор — это непосредственное воздействие ионов водорода или гидроксильных ионов на живую клетку. Этот фактор связан с особенностями протопласта клеток, в значительной степени еще невыясненными, а также активностью энзиматических систем. Второй фактор — это косвенное действие pH среды на клетку. Величина pH регулирует степень диссоциации компонентов среды. В кислой среде слабые кислоты оказываются в виде целых молекул, а щелочной — в виде ионов, так как соли слабых кислот сильно диссоциированы, а сами кислоты — слабо. При этом для каждой кислоты и соли есть определенная критическая зона pH, в которой кислота может переходить из диссоциированного состояния в недиссоциированное. Для примера можно привести данные Jarvis и Johnson (1947), полученные при исследовании влияния различных факторов внешней среды на рост пеницилла при культивировании на синтетической среде. Было показано, что присутствие уксусной кислоты в недиссоциированном виде в среде в течение фазы роста оказывало токсическое действие на рост гриба.
Некоторые микроорганизмы оказываются способными сами регулировать pH среды. Так, бактерии, образующие при сбраживании углеводов нейтральные продукты, могут в течение всего цикла развития культуры поддерживать оптимальное значение pH. При этом сначала происходит превращение углеводов до образования органических кислот, а когда кислотность среды достигает определенной величины, в действие вступают ферментативные системы, способствующие образованию не кислоты, а нейтральных продуктов, в частности спиртов. При развитии микроорганизмов на средах, содержащих белки или продукты их распада, образуются щелочные продукты, в том числе аммиак. Для борьбы с излишней щелочностью некоторые микроорганизмы имеют специальные ферментативные системы.
Изменения значения pH в процессе роста микроорганизмов оказывают существенное влияние на ход биосинтеза. Работами ряда авторов установлено, что биологический синтез антибиотиков происходит при определенных значениях pH. Например, для максимального образования тетрациклиновых антибиотиков оптимальным значением pH является 6,0—8,0, для стрептомицина — 7,0—8,5, для пенициллина 6,8—7,5. Следовательно, величина pH в процессе биосинтеза антибиотиков должна изменяться таким образом, чтобы реакция среды способствовала не только росту микроорганизма, но и образованию нужного вещества. Применительно к биосинтезу пенициллина для фазы роста продуцента величина pH должна быть близка к 6,8 и в фазе пенициллинообразования — около 7,3. Создание среды с определенным значением pH осуществляется путем подбора таких ингредиентов, которые при их использовании микроорганизмом способствуют сдвигу pH в желаемую зону. Известно, что высокие концентрации глюкозы при отсутствии нейтрализующих веществ приводят к закислению среды, вследствие образования значительного количества органических кислот.
Введение мела в качестве фактора, регулирующего pH, имеет широкое распространение в промышленности. Существенное значение оказывает его исходная концентрация. Представлены зависимости между концентрацией мела в среде, пенициллинообразованием и изменениями pH. Наиболее высокий выход пенициллина отмечается при тех концентрациях мела, которые обеспечивают в период пенициллинообразования оптимальные для биосинтеза величины pH и наименьшие колебания pH в процессе ферментации.
При ферментации глютаминовой кислоты культурой Micrococcus glutamicus используют высокие концентрации глюкозы. Чтобы обеспечить необходимый интервал pH в период активного накопления аминокислоты, в питательную среду вводят стерильный раствор мочевины.
На изменение величины pH оказывают влияние не только источники углерода, но и азота. При биосинтезе окситетрациклина на средах, содержащих глюкозу и соли аммония или нитраты, отмечаются различные колебания pH, в зависимости от источника питания. Наиболее резкое понижение pH обнаружено в тех случаях, когда при ионе аммония находятся анионы серной и соляной кислот или используется двузамещенная соль фосфорной кислоты. Величина pH зависит также от количества использованного азота. При интенсивном усвоении аммонийного азота среда закисляется в значительной степени.
В последнее время для регулирования величины pH по ходу развития микроорганизмов находят применение ионообменные смолы.
Не менее важное значение для развития микроорганизмов имеет исходная величина pH. В опытах И. В. Коновой (1959) было установлено, что диапазон благоприятных для синтеза стрептомицина начальных значений pH среды находится в пределах 7,96—5,27. Максимальное образование антибиотика отмечалось при исходном значении pH среды — 7,19, Процесс «выравнивания» активной кислотности среды происходит в течение некоторого времени, и чем дальше отстоят величины pH от оптимальных значений, тем больший промежуток времени занимает этот процесс.
По всей вероятности, более низкое содержание антибиотика в культуре, развивающейся на среде с неоптимальной величиной начального pH, можно объяснить следующим образом: биосинтез антибиотика можно представить как ряд последовательных этапов синтеза, за счет различных продуктов метаболизма продуцента. Эти продукты метаболизма продуцент образует на разных стадиях своего развития. Если значения pH во время ферментации будут такими, что накопление «полупродуктов» для синтеза будет обеспечено, то синтез самой молекулы антибиотика будет протекать успешно, с хорошим количественным выходом. Если в какие-то периоды жизнедеятельности продуцента pH среды не будет способствовать активности ферментных систем, обеспечивающих синтез необходимых метаболитов, то и синтез молекулы антибиотика будет происходить на низком уровне из-за отсутствия в среде достаточного количества необходимых полупродуктов. Таким образом, можно предположить, что, если начальное pH среды не будет оптимальным для данного продуцента, то метаболиты-полупродукты, которые должны были накапливаться на ранних этапах развития культуры, не синтезируются вовсе или синтезируются в меньшем количестве.
В зависимости от отношения к кислороду воздуха микроорганизмы условно подразделяются на две группы: аэробы и анаэробы. Культивирование аэробов происходит в условиях соприкосновения среды с воздухом. Однако если в питательной среде есть восстановители, то даже при соприкосновении среды с воздухом условия будут настолько не аэробные, что в них можно культивировать анаэробы. При наличии в среде окислителей, являющихся акцепторами водорода, в ней можно культивировать аэробы и без доступа воздуха. Таким образом, наличие окислительно-восстановительных систем в среде является одним из факторов, обусловливающих возможность развития микроорганизма, а также направление реакций метаболизма. Количественной мерой окислительно-восстановительных условий является окислительно-восстановительный потенциал. Он является показателем состояния равновесия окислительно-восстановительных систем для культивирования.
Многие химические реакции, происходящие в метаболизме микроорганизмов, сопровождаются переносом электронов. Всякое передвижение электронов отражается на величине потенциала. Таким образом, обмен веществ связан с окислительно-восстановительным потенциалом системы. Величину окислительно-восстановительного потенциала обычно выражают в вольтах, т. е. в электрическом напряжении, возникающем на электроде, погруженном в исследуемую жидкость. Величину окислительно-восстановительного потенциала в биологии принято выражать через индекс rН2. Эта величина характеризует кислородно-водородное равновесие. pH среды показывает соотношение между Н+ и ОН— ионами, а rН2 — между Н2 и O2. Кроме того, rН2 характеризует суммарное окислительно-восстановительное состояние, обусловленное не только концентрацией (парциальным давлением) кислорода и водорода, но и всеми присутствующими окислителями и восстановителями. Таким образом, rН2 дает представление об окислительной или восстановительной способности сред для культивирования или других растворов. Преимущество этой величины перед потенциалом, выраженным в вольтах, заключается в том, что величина потенциала изменяется в зависимости от pH, а в индексе rН2 pH входит как составная часть, которую определяют отдельно и учитывают при расчете.
Касаясь связи величины rН2 и pH, необходимо иметь в виду, что чем больше концентрация окислителя, тем выше потенциал. Раствор с более высоким потенциалом при смешении его с раствором с более низким потенциалом будет окислять последний. Если рассмотреть систему: водород в окисленном (в ионной форме) и восстановленном состоянии (газообразный молекулярный водород), то соотношение концентраций окисленного и восстановленного водорода примет следующий вид.
Концентрация газообразного водорода выражается через давление в атмосферах. Окислительно-восстановительный потенциал по отношению к водороду обозначается Eh. Так как условно считают потенциал нормального водородного электрода равным нулю, то уравнение Нернста принимает следующий вид так как при 20° и переводе натуральных логарифмов в десятичные равно 0,029. nF
Отрицательный lg давления молекулярного водорода по аналогии с pH обозначается rН2, тогда
Eh = 0,029 (lg [Н+]2 — lg [Н2])
Eh = 0,029 [— 2рН — (rН2)]
Eh = 0,029 (rН2 —2рН)
При равновесии раствора с атмосферой водорода при давлении 1 атм rН2 = —lg 1 = 0. Давление меньше 1 атм характеризуется величиной гН2, большей 0. Аналогично тому, как щелочность характеризуется ничтожно малой концентрацией водородных ионов, исходя из уравнения диссоциации воды, так и насыщение среды кислородом можно выразить через ничтожно малое давление водорода.
При давлении кислорода 1 атм rО = 0 и 2rН2=85,2, rН2 = 2,6, Отсюда давление кислорода 1 атм характеризуется давлением водорода 10-42,6 атм. Таким образом, rН2 от 0 до 42,6 характеризует все степени насыщения водного раствора водородом и кислородом.
Чем меньше rН2, тем больше восстановительная способность раствора. Необходимо учитывать, что rН2 далеко не всегда характеризуется реальным давлением водорода. В аэробных условиях при rН2 = 25—30 никакого реального водорода нет. Но в этом случае в равновесии с водородом находятся другие окислительно-восстановительные пары, имеющие реальные концентрации.
И. Л. Работнова (1955, 1957), внесшая наиболее значительный вклад в изучение rН2 при культивировании микроорганизмов, считает, что показатель rН2 не имеет той степени точности, которая необходима в физической химии для характеристики условий. Эта величина дает приблизительную характеристику окислительно-восстановительных условий.
Величину rН2 развивающихся культур определяют обычно при помощи электродов с прибором, регистрирующим ЭДС.
Применительно к продуцентам антибиотиков, актиномицетам и грибам условия их развития при различных окислительновосстановительных потенциалах среды изучены недостаточно. Известно, что некоторые из актиномицетов, относящиеся к группе Act. globisporus или Act. griseus, могут развиваться в широких интервалах гН2 — от 7 до 28.
Присутствие в среде Na2S2O4 вызвало понижение rН2 до 7—8, добавление КMnO4 увеличивало rН2 до 21—23 по сравнению с контролем, где rН2 14. Искусственно создаваемые условия высоких и низких значений rН2 в культуре Act. globisporus образующей активное против Вас. mycoides вещество, не вызвали его инактивацию.
И. В. Конова (1959) изучала окислительно-восстановительные условия среды при культивировании Act. griseus в глубинных условиях. В первые 2—3 суток отмечается замедленный рост подобно лаг-фазе у бактерий, величина окислительно-восстановительного потенциала в этот период остается почти на одном уровне или несколько возрастает. Некоторый подъем rН2 в начальный период развития культуры объясняется перенасыщением среды кислородом за счет замедленного роста. Затем наступает период резкого снижения потенциала, совпадающий с периодом наиболее интенсивного роста культуры. В период спорообразования и автолиза величина rН2 несколько повышается. Нарастание антибиотической активности совпадает со снижением окислительно-восстановительного потенциалу.
При культивировании Str. griseus в поверхностных культурах изменение величины rН2 отличается от описанного выше и происходит таким образом, что в течение фазы роста актиномицета значение потенциала снижается, достигает определенной низкой величины и сохраняется на этом уровне до автолиза культуры, в связи с чем значение rН2 увеличивается. Показанное различие в изменениях окислительно-восстановительного потенциала у одного и того же микроорганизма обусловлено условиями культивирования и связано с окислительно-восстановительным состоянием среды.
Наибольший интерес имеет изучение внутриклеточной величины rН2 в процессе биосинтеза антибиотиков. Пользуясь специальными индикаторами, характеризующими определенную величину rН2, З. Э. Беккер (1963) окрашивала мицелий пеницилла на разных стадиях образования пенициллина.
В начале роста отмечался rН2=10—15, в конце ферментации — 5—6. Часто основная масса мицелия показывает в период интенсивного синтеза антибиотика резкое падение rН2 от 7,0 до 3,0 и находится в этом состоянии до конца ферментации. Таким образом, до периода синтеза антибиотика наиболее интенсивно функционируют системы, участвующие в высших ступенях окисления. Сдвиг rН2 в низкие области приводит к изменению метаболизма, в частности, скорее возможно образование таких продуктов, как этанол. При высоких уровнях rН2 биосинтез пенициллина практически осуществляться не может, так как в этих условиях сера молекулы пенициллина должна была бы перейти в дисульфидную форму, что привело бы к инактивации антибиотика.